方 軍，郭樹軍，李永研

利用外周血單個核細(xì)胞（PBMC）對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是腫瘤治療中近年研究較為廣泛的一種方案。本文旨在對體外聯(lián)合應(yīng)用CD80和CD28/CpGODN共刺激活化PBMC在體外對胃癌細(xì)胞的影響及殺傷途徑作出初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康人外周血由153中心醫(yī)院血站提供，胃癌細(xì)胞株MKN45由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化內(nèi)科提供，RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品。單克隆抗體CD28干粉CD80、T細(xì)胞亞群、干粉均購自Immunotech公司，蒸餾水溶解至所需濃度，分裝，－30℃保存。CpG ODN由上海生工生物工程公司合成，其序列為5'GGGGTC AACGTIGAGGGGGG 3'，重組人IL-2為北京四環(huán)生物工程制品廠產(chǎn)品，淋巴細(xì)胞分離液為TBD生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，噻唑藍(lán) （Mar）及二甲基亞砜（DMSO）為Amresco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 外周血PBMC的分離與體外培養(yǎng) 100 ml血用 Ficoll密度梯度離心分離單核細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)（含100 ml/L滅活小牛血清），每管10 ml，分別加入維持量IL-2（20 kU/L），CD28（0.4 mg/L），CD80（0.4 mg/L）在37℃、50 ml/L CO2孵箱中培養(yǎng)1、2、3、4、5 d共5個時間段。

1.2.2 胃癌細(xì)胞株MKN45培養(yǎng) 用1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，傾出胰酶，用約2 ml RPMI 1640液輕洗1次，傾出，加2 ml 1640液吹散細(xì)胞，再加入含10%小牛血清的RPMI1640液，共10 m l。在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，直至形成單層細(xì)胞，傾出培養(yǎng)液，加入抗體誘導(dǎo)的不同時間段的PBMC培養(yǎng)1 d。對照組不作用胃癌細(xì)胞，收獲細(xì)胞，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 體外淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn) 以上法在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用胰酶消化，調(diào)細(xì)胞至不同濃度，依次分為4組：實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2將活化的PBMC與腫瘤細(xì)胞（效靶細(xì)胞）按20∶1接種至96孔板，效、靶體積均為100 μl組2加1×108mmol/L CI-988；實(shí)驗(yàn)組3用CD80（0.4 mg/L）的100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；對照組用100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。每天胰酶消化法計(jì)數(shù)每組4孔，繪制細(xì)胞在不同條件下的生長曲線，共同培養(yǎng)24 h，終止培養(yǎng)前加入MTT10 μl（5 mg/ml），37℃含5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 150 ml，充分溶解，570 nm波長酶標(biāo)儀檢測OD值。殺傷率=[1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)孔OD值）/靶細(xì)胞孔OD值]×100%。

1.2.4 電鏡觀察 將PBMC作用不同時間腫瘤細(xì)胞，用PBS清洗，加固定液，邊固定邊吹打，使細(xì)胞與固定液充分混勻，30min后，300r/min離心10min，棄上清，加固定液混勻過夜，離心半徑8 cm 3 000 r/min離心15 min收集細(xì)胞。

1.2.5 懸浮生長細(xì)胞的凋亡檢測 活化的PBMC和CD80（0.4 mg/L）和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)72 h后，用橡皮刮收集懸浮生長的細(xì)胞，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入預(yù)冷的1X結(jié)合緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，置冰浴。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI于細(xì)胞懸液中輕輕混勻。將試管置于4℃避光染色10 min。補(bǔ)加490 μl結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在SPLM軟件中輸入實(shí)驗(yàn)中各測定值，采用未配對計(jì)量資料的t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞殺傷作用 活化的外周血PBMC對腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用，效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞之比需要達(dá)到20∶1，才能達(dá)到半數(shù)殺傷率。CD80與CD28/CpG ODN活化的PBMC合用，對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷作用顯著大于CD80本身對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞殺傷作用（P<0.01），亦大于單獨(dú)應(yīng)用CD28/CpG ODN活化PBMC對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷作用（P<0.05），且靶細(xì)胞只達(dá)到15∶1就能達(dá)到半數(shù)殺傷率。主要指標(biāo)見表1、圖1。

表1 不同處理對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷率（n=3，±s，%)

表1 不同處理對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷率（n=3，±s，%)

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圖1 細(xì)胞生長曲線

2.2 電鏡結(jié)果 共刺激細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)12 h后可見，大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡，兼有壞死及凋亡細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞胞漿濃縮，核濃縮，染色質(zhì)邊集，形成花環(huán)狀；出現(xiàn)較多的凋亡小體（圖2），小體有完整的膜包裹，異染色質(zhì)邊集，可見電子密度致密的核碎片，膜內(nèi)可見細(xì)胞器及脂質(zhì)空泡；同時見活化的T細(xì)胞有較多的微絨毛、細(xì)胞體積大，胞漿變得較為豐富，核大，電子密度低，核仁明顯。

圖2 早期凋亡細(xì)胞電鏡圖（醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色6 000×）

2.3 流式細(xì)胞儀結(jié)果 流式細(xì)胞儀FCM圖像可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群壞死細(xì)胞占 31.2%，凋亡細(xì)胞占22.1%。而對照組僅有壞死細(xì)胞0.1%，凋亡細(xì)胞1.7%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有非常顯著性差異（P<0.01）。

3 討 論

T細(xì)胞受體（TCR）是參與特異性免疫的重要分子，在T淋巴細(xì)胞活化過程中識別和結(jié)合配體。研究發(fā)現(xiàn)正常個體在抗原刺激下，外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）TCRVβ基因隨抗原類型不同或疾病的不同臨床階段呈選擇性擴(kuò)增[1]。近年來對于CpG ODN的認(rèn)識越來越深入，其誘生的IL-12、INF-α、TNF對腫瘤細(xì)胞均有抑制殺傷作用，并促使TH0細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為Th1細(xì)胞，因此其在腫瘤治療方面亦漸成為熱點(diǎn)[2-4]。國外已有人基于體外容易得到的人外周血單個核細(xì)胞（PBMC），用CD3、CD28抗體在體外擴(kuò)增活化T淋巴細(xì)胞，利用激活表型為CD8+CD25+的殺傷細(xì)胞回輸治療免疫力下降引起的感染與腫瘤發(fā)生作為腫瘤免疫治療的新手段[5]。TCR CD3復(fù)合體接受抗原或相應(yīng)MOAb刺激后，可導(dǎo)致多個與之相關(guān)的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶（PTK）的活化，并通過一些PTK的底物來介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)，調(diào)控核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致T細(xì)胞活化增殖，發(fā)揮效應(yīng)功能。至于不同的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比值（簡∶效∶靶細(xì)胞比值）的殺傷效果評價(jià)，本文結(jié)果顯示，靶細(xì)胞濃度反應(yīng)比值對不同的腫瘤細(xì)胞均有一定的殺傷作用，要達(dá)到半數(shù)致死量，效∶靶細(xì)胞比值應(yīng)不小于20∶1，但是CD80與CD28/CpG ODN共刺激活化PBMC合用，只要達(dá)到15∶1就能達(dá)到半數(shù)殺傷率。本文結(jié)果還顯示，體外培養(yǎng)6 d，1 mmol/L活化T細(xì)胞和CD80（0.4 mg/L）分別可致胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞生長抑制率達(dá)91%和52%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，二者聯(lián)合使用殺傷作用更明顯，于培養(yǎng)3 d和6 d，抑瘤率達(dá)40%和97%。MTT法檢測殺傷率，聯(lián)合應(yīng)用1 mmo1/L活化外周血PBMC和1×10-8mmol/L CI-988較單用任何一種其殺細(xì)胞作用更明顯（P<0.05）。聯(lián)合應(yīng)用二者抑瘤效果較單用任何一種措施更明顯（P<0.05）。透射電鏡下體外培養(yǎng)可見兼有凋亡與壞死征象，這種現(xiàn)象同時也在體外細(xì)胞培養(yǎng)的流式細(xì)胞儀檢測中得到證實(shí)。筆者前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)活化T細(xì)胞引起結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞死亡的過程中有凋亡機(jī)制參與，因此認(rèn)為，CD80可能通過提高結(jié)腸癌細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性而與活化T細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同治療作用。本文結(jié)果驗(yàn)證了活化外周血PBMC系統(tǒng)和CD80對胃癌在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的殺傷作用，同時證明聯(lián)合應(yīng)用CD80可以提高活化外周血PBMC對胃癌細(xì)胞的殺傷作用。

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