李妙齡 杜俊蓉 周文 魏燕 劉智飛 楊艷 裴杰 曾曉榮△

(1.瀘州醫(yī)學院心肌電生理學研究室,四川 瀘州 646000;2.四川大學藥學院藥理學與生物制藥系,四川 成都 610041)

延遲整流鉀電流是心臟上一種重要的復極電流,也是抗心律失常藥物作用的靶點之一,受PKA的調控,在心室肌上主要由快速延遲整流鉀電流(IKr)和慢速延遲整流鉀電流(IKs)組成。有研究顯示[1-2]IKs特異性阻斷劑比IKr阻斷劑更具有速率依賴的優(yōu)越特性,因此是一類更具優(yōu)越性的抗心律失常藥物,但因缺乏特異性的通道阻斷藥物使其對其他離子通道具有不同程度的藥理作用而大大限制了臨床的應用。近來研究發(fā)現(xiàn),IKs阻斷劑包括苯二氮卓類和 Chromanol類衍生物,其中Chromanol類衍生物 HM R1556[3]對 IKs的選擇性比對IKr、Ito、ICa-L的選擇性高1000倍,并能增加清醒狗的QT間期,在離體狗心肌上對APD無作用。當IKr受抑制時,IKs在復極過程中尤為重要。Jurkiewicz和Sanguinetti[1]首先認為在快心率時IKs阻斷劑表現(xiàn)為優(yōu)先選擇性的延長APD作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)明顯阻斷IKs的藥物氨巴利特(Ambasilide)和阿齊利特(Azimilide)[2,4]能非頻率依賴性的延長心房的APD,與多非利特(Dofetilide)相比能更有利于拮抗對迷走神經敏感的動作電位,但這些藥物還可阻斷其他的離子電流。這使得很難明確其與純IKr阻斷劑的作用的不同機制。隨著更多的選擇性的IKs阻斷劑的不斷發(fā)展,可以更直接的評價IKs特異性阻斷劑的藥理特性。

Chromanol 293B是Chromanol類衍生物,抑制IKs選擇性作用強于Ito20倍以上,而對IKr并無作用,是目前公認的IKs特異性阻斷劑。Bosch[5]等觀察到在不同的刺激頻率下Chromanol 293B能延長豚鼠和人的心室肌的APD,而Dofetilide則具有負性頻率依賴性。

動作電位復極過程中,L-型鈣通道的功能狀態(tài)可能是誘發(fā)EAD和DAD的重要因素,研究發(fā)現(xiàn)EAD可被在慢心率時應用IKr阻斷劑所誘發(fā)[6]。也有報道維拉帕米(Verapamil)[7]能夠抑制QT間期延長綜合征(Long QT syndrome,LQTS)模型心肌細胞的QT間期的延長,減少心肌離散度,防止EAD的產生,最終阻止Tdp的發(fā)生。IKr阻斷劑在慢心率產生的明顯作用可能依賴于L-型鈣通道電流,因此 L-型鈣通道電流阻斷劑可能減少純IKr阻斷劑對慢心率的過度延長APD時程的作用。事實證明嚴重心律失常的過程中,心肌細胞內鈣調控發(fā)生機制異常。因此,發(fā)展新的具有鈣拮抗作用的復合型Ⅲ類抗心律失常藥物,將有可能有效地治療室性致死性心律失常并且具有較低的致心律失常作用。

因此本實驗應用純Ⅲ類抗心律失常藥物Chromanol 293B、多非利特與維拉帕米聯(lián)合應用來觀察不同刺激頻率下藥物相互作用是否可以改善Ⅲ類抗心律失常藥物產生的負性頻率依賴性,探索致心律失常的作用機制并指導臨床合理用藥。

1 材料和方法

1.1 動物及藥品 豚鼠,350-450g,由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供,♀♂不拘。多非利特由山東省化學藥物重點實驗室提供,純度≥99%;維拉帕米(德國Knoll AG公司);Chromanol 293B和HEPES(Sigma公司);其他試劑購于國產分析純。多非利特用鹽酸溶解,Chromanol 293B用DM SO溶解,均配成1mmol?L-1母液儲存,實驗前用新鮮臺式液稀釋至所需濃度,藥物稀釋后其PH值在7.2-7.4,藥物稀釋后最后的溶劑濃度一般不超過0.3%,此濃度對動作電位的形態(tài)無影響,每次實驗新鮮配制。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠心室乳頭肌標本的制備 將豚鼠擊頭致昏后脫頸放血,迅速分離心臟至 100%02飽和的臺式液中(mmol?L-1：NaCl 147,KCl 5.4,CaCl21.8,MgCl21.05,HEPES 10,Glucose 11,使用前用NaOH調節(jié)pH至7.4),快速分離右心室乳頭肌(選取直徑0.4-0.8mm),從水平方向給予標本約0.5g的前負荷固定于10ml的恒溫浴槽底部的硅膠片上,以持續(xù)100%O2、溫度為36±0.5℃的臺氏液灌流,流速3ml?min-1,平衡 2h后用于實驗。

1.2.2 豚鼠心室乳頭肌動作電位的記錄[8]肌條平衡2h后,應用一對鉑金電極置于肌條的兩側(離肌條約0.2-0.3mm)作為刺激電極。用有芯玻璃毛細管(Havard,USA)在拉制儀(P-97,Sutter,USA)上拉制成玻璃微電極,將充灌3mol?L-1KCl的玻璃微電極(阻抗 20-30MΩ)插入Ag-AgCl引導電極,固定于三維微操縱器(Narishige,Japan)上,用參比電極接地。電極入水后調零,緩慢插入電極至出現(xiàn)靜息電位(RP)時,由電子刺激器(SEN-7203;Nihon Kohden,,Japan)發(fā)放刺激脈沖(2ms,1.5倍閾電壓),通過隔離器(SS-202J,Nihon Kohden,Japan)將形成的場刺激作用于豚鼠乳頭肌,誘發(fā)乳頭肌的動作電位。這種引導的生物信號通過微電極放大器(M EZ-7200;Nihon Kohden,Japan)放大后應用生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420 E+,泰盟,成都)在計算機上進行實時采集和分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 實驗分組 動作電位記錄穩(wěn)定30min后給予浴槽終濃度為：①293B：Control;1μ mol? L-1;5μ mol? L-1;10μ mol?L-1);②293B 10μ mol? L-1+多非利特 0.1μ mol? L-1。 ③293B 10μ mol? L-1+多非利特 0.1μ mol? L-1+維拉帕米(0.1,1,2.5μ mol?L-1)。采用 10KHz采樣頻率和 1HZ的基本刺激頻率引導并記錄動作電位,待穩(wěn)定30min后所記錄的動作電位作為每組加藥前的對照組(Control),然后依次給予0.2Hz,0.5Hz,1Hz,1.25Hz,2Hz刺激頻率,每種刺激頻率持續(xù)約3～5min。不同頻率刺激結束后又回到1Hz刺激,加藥后觀察到APD較為穩(wěn)定后(一般約15min),再給予以上的不同頻率,觀察不同刺激頻率對豚鼠心室乳頭肌動作電位的影響。不同濃度給藥按上述方式重復。

1.2.4 觀察指標

靜息電位(RP),動作電位幅值(APA),復極 30%的 APD(APD30),復極 50%的 APD(APD50),復極 90%的 APD(APD90)。

1.3 統(tǒng)計處理

2 結果

2.1 Chromanol 293B對豚鼠乳頭肌AP的影響

Chromanol 293B濃度依賴性的延長動作電位時程(圖1,1Hz,n=6),293B在1μ mol?L-1時開始對 APD有延長作用,與對照組相比延長 APD90達(3.84±0.24)%,當增加 293B至5μ mol? L-1延長 APD90達(7.53±1.06)%,當濃度增加到10μ mol? L-1明顯延長APD90達(23.48±3.56)%。不同濃度的293B對APA和RP無明顯影響。給予不同的刺激頻率,可以觀察到隨著刺激頻率的增高,APD90變化的百分比與刺激頻率1Hz相比,沒有明顯差異,表現(xiàn)為一種非頻率依賴性作用(圖1)。

2.2 Chromanol 293B與多非利特(DO)合用對豚鼠心室乳頭肌AP的影響

圖1 Chromanol 293B(1-10μ mol?L-1)對豚鼠心室乳頭肌肌動作電位作用的原始記錄圖(1Hz)

圖2 C hromanol 293B(10μ mol?L-1)與多非利特(100nmol?L-1)聯(lián)合應用導致的異常電活動(1Hz)

293B(n=6)在10μ mol?L-1對APD和 RP無明顯影響,能非頻率依賴性的延長豚鼠乳頭肌APD;當加入 DO 0.1μ mol?L-1后3min開始繼續(xù)延長APD,持續(xù)作用約15min達到平衡狀態(tài),實驗中發(fā)現(xiàn)在IKs特異性阻斷劑293B作用后再加入IKr特異性阻斷劑DO使APD延長明顯,極易誘發(fā)早后除極(EAD)和晚后除極(DAD)(圖2)。在不同的刺激頻率作用下,與1Hz頻率相比,1.25Hz下的APD90變化%有統(tǒng)計學差異(P＜0.05,n=6),1Hz與2Hz相比差異明顯(P＜0.01,n=6),1Hz與0.2、0.5Hz相比差異異常明顯(P＜0.001,n=6),Chromanol 293B與多非利特合用后表現(xiàn)為明顯的負性頻率依賴性(圖3)。

2.3 Chromanol 293B與多非利特合用后再聯(lián)合應用維拉帕米(VE)對豚鼠乳頭肌AP的影響

Chromanol 293B(10μ mol? L-1)與多非利特(0.1μ mol?L-1)作用后加入不同濃度的維拉帕米(0.1,1,2.5μ mol?L-1,n=6)(圖4),可以看出0.1μ mol?L-1維拉帕米使 APD縮短,能使異常電活動消失(EAD或 DAD),1μ mol?L-1維拉帕米可使APD進一步縮短,當再增加濃度至2.5μ mol?L-1縮短APD的作用減弱。

圖3 在不同刺激頻率下 293B(10μ mol? L-1)、多非利特(100n mol?L-1)和維拉帕米(1μ mol?L-1)分別或聯(lián)合應用的 APD 90變化的百分比(,n=6,＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.001vs 1Hz)

圖4 不同濃度維拉帕米(0.1-2.5μ mol?L-1)對 C hromanol 293B(10μ mol?L-1)與對多非利特(100n mol?L-1)聯(lián)合應用對動作電位作用的原始記錄圖(1Hz)

給予不同的刺激頻率,1μ mol?L-1維拉帕米使 APD90均有不同程度的減小,減弱了293B與多非利特共同作用下的過度延長APD的作用,但作用程度不一。加入維拉帕米后,其他刺激頻率的 APD90變化%與 1HZ相比：1Hz與 0.5Hz、1.25Hz、2Hz相比,APD90變化%差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,n=6),與0.2Hz相比差異明顯(P＜0.01,n=6)。維拉帕米與293B和多非利特聯(lián)合應用減弱了其延長APD的作用,亦減弱了其對頻率的依賴性(圖3,表 1)。

3 討論

本文研究表明：在活性正常的豚鼠心室乳頭肌標本上,Chromanol 293B能非頻率依賴性的延長 APD。Chromanol 293B與多非利特聯(lián)合應用表現(xiàn)為負性頻率依賴性的延長APD,能通過改變L-型鈣通道的動力學特性來改善其負性頻率依賴性。Iks特異性阻斷劑與Ikr特異性阻斷劑的聯(lián)合應用并不能改變 Ш類抗心律失常藥物的負性頻率依賴性。這些發(fā)現(xiàn)提示同時阻斷幾種鉀通道的藥物很可能比特異性通道阻斷劑危險性更大。

實驗中我們觀察了 0.1,1,2.5μ mol?L-1維拉帕米對APD的影響,結果顯示低于1μ mol?L-1雖能改善過度延長APD導致的異常電活動(EAD,DAD)但對改善其頻率依賴性影響不明顯,而達到 2.5μ mol?L-1因完全阻斷 ICa-L可能誘導新的心律失常,因此在實驗中選擇了1μ mol?L-1的維拉帕米,并觀察到了其有益的抗心律失常的作用。

維拉帕米可以適度緩減在慢心率時APD的過度延長,減弱在慢心率時的副作用,表現(xiàn)為一種負性頻率依賴性減弱的有益作用,而維拉帕米本身并無頻率依賴型,表明了不同頻率依賴性的兩種藥物的相互作用產生了較好的藥效。有報道表明[9]鈣通道阻斷劑可以直接抑制 EAD的形成,降低已形成EAD的幅度,還可減弱對周圍組織發(fā)生觸發(fā)活動的能力。因此這種作用可能通過限制APD的過度延長和限制復極離散度的增加來減弱這種負性頻率依賴性的程度。最近的研究[10]發(fā)現(xiàn)鈣通道活性的恢復可能是EAD產生的載體,有產生Tdp危險傾向者可能是內在的平衡被打破,過度延長APD或加速了鈣通道的恢復都可能導致EAD,最終出現(xiàn) Tdp。因此,鈣通道的功能狀態(tài)和心室的復極化被認為是一種“生理學上的穩(wěn)態(tài)”。我們的實驗也支持：延長整流鉀通道阻斷劑與L-型鈣通道阻斷劑的聯(lián)合應用(按適當?shù)谋壤?可以發(fā)揮這樣的保護作用。也有報道在動物模型中[11],90%的IKr阻斷劑過度延長APD最后都導致了EAD的出現(xiàn),然而約20%阻斷ICa卻能使EAD消失,并保持APD的延長作用,這也暗示了這種結果的產生可能受諸多因素的影響,也可以說明在形成動作電位的各離子機制中,鈣通道起到了調節(jié)其他離子通道活性的重要作用。我們的研究結果證實了L-型鈣通道阻斷劑改善了Ⅲ類抗心律失常的負性頻率依賴型,鈣通道功能狀態(tài)可能是產生負性頻率依賴性的多因素之一。

對鈣通道阻斷作用的可能解釋是：慢心率時(平臺期變長)L-型鈣通道很容易被再次激活。在阻斷復極化電流的過程中,雖然內向電流只引起小的變化,但卻在平臺期的終末引起明顯的APD的變化。這種現(xiàn)象很可能說明在慢心率時內向L-型鈣通道活性能夠調節(jié)Ⅲ類抗心律失常藥物的作用。由于APD過度延長使失活的L-型鈣通道被再激活使胞外Ca2+內流增強,胞漿內Ca2+濃度升高,心肌細胞中的RyR2被胞外鈣內流所激活,由此通過“鈣觸鈣釋放”方式觸發(fā)肌漿網上的RyR2釋放更多的鈣,使胞內游離鈣明顯增多。而L-型鈣通道阻斷劑可以縮短 APD,減少鈣超載現(xiàn)象,1μ mol?L-1Verapamil可以適度縮短APD,減少胞外鈣內流,調節(jié)胞內鈣信號調控系統(tǒng)。

這樣的研究結果可能對臨床應用具有一定的指導意義,在臨床上將Ⅲ類抗心律失常藥物與鈣通道阻斷藥聯(lián)合應用可以減少Ⅲ類抗心律失常藥物的致心律失常作用。通過對鈣通道活性的調節(jié)來改變抗心律失常的作用,有利于穩(wěn)定抗心律失常的作用。也有報道表明,鈣通道阻斷劑可以抑制與EAD相關的快速性心律失常、QT間期的延長。這種作用類似于Amiodarone和Azimilide,這些復合性的Ⅲ類抗心律失常藥物包含有鈣通道阻斷作用和純Ⅲ類抗心律失常藥物的作用。

表1 Chromanol 293B(10μ mol?L-1)、多非利特(100nmol?L-1)與維拉帕米(1μ mol?L-1)分別或聯(lián)合應用對動作電位各參數(shù)的作用(1Hz,,n=6)

表1 Chromanol 293B(10μ mol?L-1)、多非利特(100nmol?L-1)與維拉帕米(1μ mol?L-1)分別或聯(lián)合應用對動作電位各參數(shù)的作用(1Hz,,n=6)

注：與對照組相比：＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.001

RP AP APD20 APD50 APD90 0.2Hz Control -74.2±0.7 114.7±0.9 99.2±1.6 190.5±4.7 237.5±3.8293B -73.6±0.8 115.5±0.4 102.7±3.6 243.7±1.6＊＊＊ 279.6±4.9＊＊＊293B+DO -73.5±1.4 115.6±1.1 118.7±1.9＊＊ 286.4±2.4＊＊＊ 343.2±4.6＊＊＊293B+DO+VE -74.8±2.3 116.8±2.6 114.9±1.4＊＊ 257.2±3.9＊＊＊ 302.4±3.8＊＊＊0.5Hz Control -73.7±1.2 114.8±0.5 95.8±1.5 181.4±1.4 224.9±1.9293B -74.8±1.4 116.1±0.7 100.4±1.6＊ 217.6±3.5＊＊＊ 267.3±2.5＊＊＊293B+DO -74.3±2.2 115.3±0.6 114.2±1.4＊＊＊ 247.5±4.3＊＊＊ 296.2±3.7＊＊＊293B+DO+VE -75.5±1.6 115.2±1.7 111.6±3.3＊＊＊ 239.2±2.9＊＊＊ 287.6±3.5＊＊＊1Hz Control -75.3±1.0 114.6±1.9 81.8±1.8 158.4±3.4 199.2±2.7293B -74.8±0.9 115.3±0.6 93.8±1.7＊ 201.3±3.2＊＊＊ 246.8±3.2＊＊＊293B+DO -75.3±0.4 116.2±1.4 103.8±2.6＊ 227±2.7＊＊＊ 277.2±3.2＊＊＊293B+DO+VE -75.4±1.3 115.1±1.1 99.6±2.0＊＊＊ 216±2.8＊＊＊ 262.6±2.7＊＊＊1.25Hz Control -74.7±0.6 115.4±2.6 78.4±0.7 157.2±1.9 192.6±2.2293B -75.4±0.5 114.7±1.4 83.3±1.5 191.4±1.7＊＊＊ 227.4±1.5＊＊＊293B+DO -75.1±0.9 115.5±2.1 95.6±2.7 210.2±1.6＊＊＊ 246.2±1.9＊＊＊293B+DO+VE -75.6±0.5 115.8±2.0 91.2±2.1 200±2.3＊＊＊ 235.4±2.4＊＊＊2Hz Control -74.6±1.9 115.6±0.8 74.2±1.4 128±2.7 161.4±2.5293B -74.5±1.4 115.5±0.6 79.8±2.3 160.8±2.1＊＊＊ 192.4±1.4＊＊＊293B+DO -74.7±0.8 114.6±1.4 89.4±2.5 177.8±2.4＊＊＊ 214.2±2.6＊＊＊293B+DO+VE -74.7±1.5 115.4±1.3 84.8±2.4＊＊＊ 174.2±2.3＊＊＊ 209.2±2.3＊＊＊

抗心律失常藥物的致心律失常的離子機制極為復雜,找尋抗心律失常的作用靶點是目前研究的熱點,多靶點的協(xié)同作用有利于抗心律失常的有利作用,盡量減少由此產生的致心律失常作用。我們的研究顯示Ⅲ類抗心律失常藥物與Ⅳ類抗心律失常藥物在一定劑量的聯(lián)合應用可以改善Ⅲ類抗心律失常藥物的致心律失常作用,但抗心律失常的機制是復雜的,很多藥物均與多通道作用有關,因此開發(fā)的抗心律失常藥物希望其僅延長快速性心律失常的APD,對竇性心律失常無作用,應用計算機輔助方法研發(fā)的藥物應有利于改變速率依賴性的延長APD,鉀通道阻斷劑與鉀通道的相互作用具有時間和狀態(tài)的依賴性。從分子藥理學考慮發(fā)展一種狀態(tài)依賴性的鉀通道阻斷劑其作用靶點僅為病理性快速心律失常,而作用靶點在鉀通道的藥物對快速性心律失常作用特別重要,因此鉀通道阻斷劑仍然是抗心律失常藥物研究的重點。

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