穆建琴 ，魏路清

(1.武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300162;2.新疆阿克蘇武警兵團(tuán)指揮部，阿克蘇 843000)

肺纖維化是以肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白沉積為特征的慢性炎癥性疾病。發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，臨床上缺乏有效的治療手段。因此，探索新的治療方法或治療途徑是目前亟待解決的問題。目前肺纖維化的研究已經(jīng)趨向于多因子，多因素的綜合研究。研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化的起始階段表現(xiàn)為肺泡炎，此時大量炎性細(xì)胞向肺內(nèi)浸潤、活化，釋放多種細(xì)胞因子，形成瀑布效應(yīng)，激活多種細(xì)胞，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞活化、增殖和分泌胞外基質(zhì)，最終形成肺纖維化。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種重要的多肽生長因子，也是FGF家族中原型成員之一。隨著對細(xì)胞因子在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中作用認(rèn)識的逐漸深入，有研究[1]發(fā)現(xiàn)bFGF在纖維化的肺組織、血清、肺泡灌洗液中有高表達(dá)并呈正相關(guān)，這提示bFGF表達(dá)增強(qiáng)與肺纖維化關(guān)系密切，本研究采用博萊霉素氣管內(nèi)注入，復(fù)制肺纖維化動物模型，抗bFGF抗體進(jìn)行干預(yù)，通過HE染色觀察肺泡炎和Masson染色觀察肺纖維化 ，檢測肺組織、血清及肺泡灌洗液(BALF)中bFGF的變化，探索抗纖維化作用的機(jī)制與抗bFGF抗體中和bFGF抑制其表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

Wistar大鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所。鹽酸氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司)，0.1 g。博萊霉素(A5，批號051003，天津太河制藥有限公司生產(chǎn))，8 mg?？筨FGF抗體(購于北京賽馳生物公司)，0.5 ml(效價1∶12500)。bFGF定量酶免疫測定(ELISA)試劑盒，購于河北博海生物公司。

1.2 動物模型的建立[2]和實驗分組

選擇雌性Wistar大鼠30只，體重180～250g，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組(n=10):(1)對照組(C組);(2)模型組(M組);(3)抗bFGF抗體組(K組)。以鹽酸氯胺酮(100mg/kg，0.1 g)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，經(jīng)頸正中切口，M組、K組給大鼠氣管內(nèi)注入博萊霉素復(fù)制肺纖維化模型，C組氣管內(nèi)注入同等劑量的生理鹽水作對照，K組于造模后1，2，3，8，12，19，25 d 腹腔內(nèi)注射抗 bFGF 抗體 。上述各組均于注藥后第1周、第4周各宰殺5只。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)本的采集 大鼠麻醉后稱體重、開腹，用鹽水紗布鈍性分離暴露腹主動脈，采集動脈血分別行血氣分析檢查及留取血清標(biāo)本，離心后于-70℃凍存，待測bFGF。處死動物后開胸，于頸部切斷主氣管，向下剝離，取出全肺稱重，以便計算肺系數(shù)，計算公式為肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g)×100%。結(jié)扎左肺門，切除左全肺，于-70℃凍存留作其他檢查。經(jīng)氣管置人12號鈍性針頭，結(jié)扎后以無菌生理鹽水灌洗右肺，每次5 ml，灌洗 3次，回收灌洗液，BALF離心后上清液分裝于無菌離心管中，置于-70℃凍存，待測bFGF。經(jīng)氣管向右肺注入10%的中性福爾馬林4～6 ml使胸膜展開，結(jié)扎氣管，再置于10%福爾馬林中固定，制備石蠟切片供組織學(xué)檢查。

1.3.2 肺泡炎、肺纖維化程度 觀察方法參照文獻(xiàn)的嚴(yán)重程度分級方法進(jìn)行累積評分，統(tǒng)計學(xué)處理后加以比較。具體步驟如下:(1)進(jìn)行HE染色，參照Szapiel[3]等方法，觀察肺泡炎程度。(2)參照Fulmer[4]方法 ，利用Masson氏三色染色的切片觀察肺纖維化的情況。

1.3.3 免疫組化法檢測肺組織bFGF表達(dá) 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，然后按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。應(yīng)用圖像分析，每張片子取5個視野，bFGF陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色細(xì)顆粒狀，分別測定其在本視野的面積百分比的均值，作為該大鼠的測定值。

1.3.4 ELISA測定血清和肺泡灌洗液的bFGF含量將離心后的血清和肺泡灌洗液的上清液置于-70℃凍存，依照bFGF ELISA試劑盒說明書的步驟操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺系數(shù)變化

1、4周時M組肺系數(shù)高于C組(P＜0.05)，K組低于M組(P＜0.05)。

2.2 肺組織病理學(xué)改變

C組肺組織結(jié)構(gòu)正常(圖1A，2F)。1周時M 組表現(xiàn)為肺泡炎及肺間質(zhì)炎癥(圖1B，2G)，K組肺泡炎較M組減輕(圖1C，2H);4周時M組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)纖維組織增生，形成廣泛性纖維化，但仍有肺泡炎存在(圖1D，2I)，K組肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡腔有少量炎細(xì)胞滲出，肺泡間隔輕度增厚，間質(zhì)纖維組織增生不明顯，無明顯纖維化改變(圖1E，2J，圖1，2見下頁)。其累積評分見表1。

Tab.1 Changes of lung coefficients，histopathology and arterial oxygen tension(，n=5)

Tab.1 Changes of lung coefficients，histopathology and arterial oxygen tension(，n=5)

C:Control group;M:Model group;K:Anti-bFGF group;1 mmHg=0.1333 kPa*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs M group

Group First week Lung coefficients Alveolar catarrh degree(score) PaO2(mmHg)Fourth week Lung coefficients Pulmonary fibrosis degree(score) PaO2(mmHg)C 9.6±1.7 1.2±0.4 96.8±13.8 9.7±1.5 1.0±0.0 97.0±10.3 M 13.3±1.7* 3.6±0.5** 61.5±20.7* 14.2±1.8* 4.2±0.8** 57.5±13.6*K 12.3±2.7* 2.8±0.9* 64.3±13.7* 11.8±1.7* 2.7±0.8** 76.8±12.6

2.3 各組大鼠PaO2變化

1周時M組低于C組(P＜0.05)，K組與M組差異無顯著性(P＞0.05)，4周時M組PaO2低于C組(P＜0.05)，K組的PaO2高于M組(P ＜0.05，表1)。

2.4 各組大鼠肺組織免疫組化bFGF的變化

1周時M組(圖3L)的bFGF表達(dá)高于C組(圖3K，P＜0.01)，K組(圖3M)的bFGF表達(dá)低于M組(P＜0.01);4周時M 組(圖3N)的bFGF表達(dá)高于C組(P＜0.01)，K組(圖3O)的bFGF表達(dá)低于M 組(P＜0.01，表2)。

Tab.2 bFGF concentration changes in lung，serum and BALF of the rats(，n=5)

Tab.2 bFGF concentration changes in lung，serum and BALF of the rats(，n=5)

C:Control group;M:Model group;K:Anti-bFGF group*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs M group

Group Lung First week Fourthweek Serum First week Fourth week BALF First week Fourth week C 0.167±0.031 0.155±0.016 0.182±0.014 0.170±0.115 0.711±0.039 0.711±0.039 M 0.276±0.017** 0.294±0.027** 0.457±0.034** 0.368±0.032 0.655±0.039 0.799±0.013**K 0.203±0.051## 0.205±0.052## 0.265±0.167# 0.174±0.012## 0.204±0.030## 0.169±0.031##

2.5 各組大鼠血清及肺泡灌洗液bFGF的變化

血清中bFGF的表達(dá):1周時M組的表達(dá)高于C組(P＜0.01)，K組表達(dá)低于M 組(P＜0.05);4周時M組的表達(dá)高于C組(P＜0.01)，K組表達(dá)低于M組(P＜0.01)。肺泡灌洗液(BALF)中bFGF的表達(dá):1周時M組的表達(dá)與C組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，K組表達(dá)低于M組(P＜0.01);4周時M組的bFGF表達(dá)高于C組(P＜0.01)，K組表達(dá)低于M 組(P＜0.01，表2)。

Fig.1 Light micrographs of rat lung on 1，4 week in each group(HE ×100)

Fig.2 Light micrographs of rat lung on 1，4 week in each group(Masson ×100)

Fig.3 Light micrographs of rat lung on 1，4 week in each group(immunohistochemistry ×100)

3 討論

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是指原因不明并以炎性細(xì)胞的聚集、膠原蛋白的過度沉積及成纖維細(xì)胞的異常增殖和分化為主要特征的一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病。本實驗采用博萊霉素氣管內(nèi)注入復(fù)制肺纖維化動物模型，選擇模型的肺泡炎高峰期(1周)、肺纖維化形成穩(wěn)定期(4周)作為觀察點，通過腹腔注射抗bFGF抗體進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1、4周時M組肺系數(shù)高于C組(P＜0.05)，K組低于M 組(P＜0.05)。肺系數(shù)的改變顯示抗bFGF抗體干預(yù)后肺纖維化程度減輕;各組大鼠PaO2變化:1周時M 組低于C組(P＜0.05)，K組與M組差異無顯著性(P＞0.05)，4周時M組PaO2低于C組(P＜0.05)，K組的PaO2高于M組(P＜0.05)。血氣分析檢查亦顯示K組PaO2比M組改善;M組1周病理改變肺泡炎及肺間質(zhì)炎癥，4周時M組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)纖維組織增生，形成廣泛性纖維化，但仍有肺泡炎存在;K組1周時肺泡結(jié)構(gòu)存在，肺泡間隔增生程度輕，肺泡炎范圍小，膠原纖維增生程度輕。K組4周肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡腔有少量炎細(xì)胞滲出，肺泡間隔輕度增厚，間質(zhì)纖維組織增生不明顯，無明顯纖維化改變。本實驗從M組病理結(jié)果可以看出，博萊霉素氣管內(nèi)注入復(fù)制肺纖維化動物模型是成功的，此模型作為目前國際上IPF研究的動物模型，依據(jù)是病理改變符合藥物性肺纖維化。以上結(jié)果表明抗bFGF抗體干預(yù)后，K組大鼠的肺纖維化程度明顯較M組減輕，故可以證明抗bFGF抗體干預(yù)后可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。

細(xì)胞因子中和抗體有著廣闊應(yīng)用前景，不但可以單純阻斷單個細(xì)胞因子的作用，而且由于其相互作用網(wǎng)絡(luò)的存在，這些抗體的使用必然會為揭示網(wǎng)絡(luò)結(jié)點之間的數(shù)理關(guān)系提供有用的線索。已在實驗中得到證實[5，6]抗纖維化細(xì)胞因子IFNγ可明顯減輕博萊霉素或二氧化硅誘發(fā)的肺纖維化。國外[7]最近發(fā)現(xiàn)肺纖維化時，內(nèi)皮素的表達(dá)增加，內(nèi)皮素受體拮抗劑可減輕博萊霉素誘發(fā)的肺纖維化。本研究就是基于上述理論依據(jù)，采用腹腔注射抗bFGF抗體進(jìn)行干預(yù)，通過檢測肺組織、血清及BALF中bFGF的變化，探索肺纖維的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果提示，從免疫組化圖片可以看出，bFGF主要表達(dá)于大氣道壁和血管壁的平滑肌細(xì)胞，正常組僅在氣管平滑肌少量表達(dá);M組1周時bFGF免疫組化呈陽性反應(yīng)，K組的bFGF表達(dá)較M組減少;M組4周時bFGF免疫組化呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，K組的bFGF表達(dá)與同期的M組相比，免疫組化反應(yīng)有較明顯的減弱。K組1，4周經(jīng)過bFGF抗體與抗原結(jié)合后，肺纖維化程度明顯較M組減輕。從上述結(jié)果中可以看出，肺纖維化的程度與bFGF表達(dá)呈正相關(guān)。此結(jié)果與文獻(xiàn)[8]報道一致。1周時K組的血清及BALE中bFGF的表達(dá)與C組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，4周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明1周時為肺泡炎癥期，bFGF的表達(dá)不高，Osaki等[1]發(fā)現(xiàn)bFGF and TGF-β通過分別誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和分化而在肺纖維的不同階段分別起關(guān)鍵性的作用，常發(fā)現(xiàn)bFGF在肺纖維化期(4周)高表達(dá)并起促纖維化作用，方向群[9]等發(fā)現(xiàn)bFGF在肺纖維化模型的14天后水平開始升高。結(jié)合本實驗結(jié)果，4周時K組的肺組織、血清及BALE中bFGF的表達(dá)與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻(xiàn)[9]報道一致。

近年來，隨著bFGF及其抗體研究的深入，發(fā)現(xiàn)通過抑制bFGF生物活性從而抑制某些組織病變，阻斷疾病的發(fā)生發(fā)展。bFGF由于可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生和膠原纖維的合成而被認(rèn)為是一個與肺纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子。在肺纖維化的發(fā)展中，成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維的形成是病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，而成纖維細(xì)胞的調(diào)控受巨噬細(xì)胞分泌的bFGF的影響，兩者關(guān)系密切。Rcily等[10]研究證明，抗bFGF抗體中和bFGF，抑制bFGF與成纖維細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而抑制其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。bFGF的分泌方式是自分泌或旁分泌，通過細(xì)胞損傷或死亡釋放出來而起作用。bFGF的受體廣泛分布于膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中。bFGF與其受體結(jié)合，能產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增生分化和血管生成，阻止細(xì)胞凋亡，刺激和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化增殖。成纖維細(xì)胞生長因子通過作用細(xì)胞表面酪氨酸激酶受體發(fā)揮它們的生物活性。本實驗的結(jié)果再次可以證實，bFGF在肺纖維化期起作用并與肺纖維化程度呈正相關(guān)，應(yīng)用抗bFGF抗體中和bFGF，把病變控制在肺泡炎階段，抑制bFGF與成纖維細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而阻止了成纖維細(xì)胞增殖與纖維化的發(fā)展。這為臨床肺纖維的發(fā)病機(jī)理提供了理論依據(jù)，為肺纖維化的治療提供了一個新的方法。

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