李旭升，傅永強(qiáng)，周 標(biāo)，胡 野，陳國(guó)榮

(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321017;2.溫州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江 溫州 325000)

骨骼肌是胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖攝取的主要部位，也是糖尿病損害的主要靶位。膈肌作為重要的呼吸肌，具有終身持續(xù)收縮特性，對(duì)于維持生物體的肺功能具有極其重要的作用[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，GbE)可減輕自由基和過(guò)量一氧化氮對(duì)1型糖尿病大鼠膈肌的損傷[2]。本研究旨在探討GbE對(duì)2型糖尿病大鼠膈肌收縮能力和能量代謝酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑

GbE購(gòu)自北京雙鶴天然藥物有限公司(舒血寧注射液，批號(hào)319163.0606)，每支裝 5 ml，折合GbE為17.5 mg(含總黃酮醇苷4.2 mg;含銀杏內(nèi)酯0.70mg)。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司，臨用前溶解于0.1 mmol/L枸椽酸緩沖液內(nèi)，pH=4.0。細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，CCO)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)方案

雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，體重(180～250)g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組10只、造模組30只。正常組喂以普通飼料，造模組喂以高糖高脂飼料(飼料組成:10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食、進(jìn)水。4周后，造模組在禁食16 h后按25 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素，對(duì)照組腹腔注射等容積枸椽酸緩沖液。72 h后尾靜脈采血用血糖儀(one TouchⅡ型，強(qiáng)生中國(guó)有限公司)測(cè)定尾靜脈全血血糖，≥13.8 mmol/L為模型成功。隨機(jī)選取造模成功大鼠20只平均分成2組:糖尿病組、GbE治療組。GbE治療組按8 mg/(kg?d)劑量腹腔注射GbE，對(duì)照組及糖尿病組腹腔注射等容積生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。

1.3 膈肌收縮能力測(cè)定

在戊巴比妥腹腔注射麻醉下，迅速剖開(kāi)腹腔，取左側(cè)肋膈肌(包括中心腱及部分肋骨)，置于盛有Krebs氏液的平皿中，持續(xù)通入 95%O2和5%CO2的混合氣體，依肌纖維走行方向修剪成寬約0.8 cm的肌條待用。參照Coombes和沈興平等[3，4]的檢測(cè)方法，將膈肌條垂直懸掛于盛滿(mǎn)37℃Krebs氏液(95%O2，5%CO2)的麥?zhǔn)显〔壑?。肋骨端固定在浴槽底部，中心腱端連接于張力換能器(貝科監(jiān)控儀器有限公司)。調(diào)節(jié)肌肉至最適初長(zhǎng)度(L0)，靜置穩(wěn)定20min，兩個(gè)鉑金絲電極置肌條兩邊，電子刺激器以超最大電壓(約20V)刺激膈肌。張力換能器的輸出信號(hào)由智能八道生理記錄儀記錄分析。測(cè)定下列參數(shù):

(1)單收縮張力(Pt):每根肌條測(cè)定兩次在L0時(shí)的Pt，每次刺激(強(qiáng)度20.00V，波寬2 ms)間隔2 min。以?xún)纱纹骄底鳛闇y(cè)定值，用肌肉橫截面積(cross-sectional area，CSA)校正(單位:kg/cm2)[4]。

(2)最大強(qiáng)直張力(P0):在單收縮刺激后靜置10min ，肌條予 100Hz，20.00V ，波寬 2 ms，串長(zhǎng) 400ms刺激，測(cè)定P0，其值由CSA校正(單位:kg/cm2)。

(3)疲勞指數(shù)(FI):予肌條20.00V，波寬2 ms，每分鐘30串，每串5波，每波5 Hz，串間隔1 s，總刺激10min，致膈肌疲勞，2 min后測(cè)疲勞后張力，取2次平均值為測(cè)定值，將其與Pt之比作為FI值。

1.4 膈肌能量代謝酶活性測(cè)定

制備肌條同時(shí)取部分膈肌，秤重剪碎，以1∶10(質(zhì)量比)比例加入生理鹽水，勻漿，以400×g離心10min，取上清 200μl，稀釋成 5倍體積濃度，測(cè)酶活性。采用考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定蛋白含量。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

1.5 膈肌超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

取膈肌組織，制成1 mm3小塊，置于2.5%戊二醛溶液中固定，常規(guī)PBS漂洗，丙酮梯度脫水，E-pon812包埋。LKB超薄切片機(jī)切片，日立H600A型透射電鏡下觀(guān)察。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膈肌收縮能力的比較

與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠膈肌Pt、P0、FI水平明顯降低(P ＜0.01);GbE治療組 Pt、P0、FI水平顯著高于糖尿病組(P＜0.05，表1)。

Tab.1 Comparison of contraction capacity in diaphragm among the three groups()

Tab.1 Comparison of contraction capacity in diaphragm among the three groups()

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs diabetic

Group n Pt(kg/cm2)P0(kg/cm2) FI Control 100.73±0.11 1.96±0.17 0.46±0.10Diabetic 90.37±0.12**1.09±0.33**0.29±0.04**GbE treatment 100.52±0.16**#1.56±0.50*#0.40±0.13#

2.2 各組大鼠膈肌能量代謝酶的比較

與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠膈肌CCO、LDH、SDH活性明顯降低(P＜0.01);GbE治療組CCO、LDH、SDH活性顯著高于糖尿病組(P＜0.01，P＜0.05，表 2)。

Tab.2 Comparison of the activities of energy metabolism enzymes in diaphragm among the three groups()

Tab.2 Comparison of the activities of energy metabolism enzymes in diaphragm among the three groups()

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs diabetic

Group n CCO(U/mg pro)LDH(U/g pro)SDH(U/mg pro)Control 1032.44±5.671.62±0.27 15.57±1.16 Diabetic 921.65±7.41**1.34±0.32**10.32±1.80**GbE treatment 1028.91±6.46#1.48±0.39#13.34±2.08##

2.3 膈肌超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

正常對(duì)照組大鼠膈肌線(xiàn)粒體呈圓形或橢圓形，無(wú)腫脹，線(xiàn)粒體膜完整，線(xiàn)粒體嵴呈同心圓或縱行排列，嵴密集清晰、排列規(guī)則;肌原纖維密集，排列整齊，肌節(jié)各帶清晰(圖1A)。糖尿病組大鼠膈肌線(xiàn)粒體腫脹，膜模糊不清，部分膜破裂，嵴排列紊亂，數(shù)量減少甚至消失形成空泡，肌原纖維排列紊亂(圖1B)。GbE治療組大鼠膈肌線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)明顯輕于糖尿病組，多數(shù)線(xiàn)粒體嵴排列較規(guī)則，少數(shù)嵴腫脹模糊及斷裂或空泡現(xiàn)象;肌原纖維排列整齊，各帶清晰(圖1C)。

Fig.1 Ultrastructure of diaphragm from three groups(×20k)

3 討論

糖尿病的高血糖狀態(tài)具有普遍的毒性作用，骨骼肌也是糖尿病損傷的主要部位。糖尿病對(duì)膈肌結(jié)構(gòu)、功能的損害，有別于其它骨骼肌[5]。膈肌除具有骨骼肌的一般生化、生理和結(jié)構(gòu)功能外，尚具有終身持續(xù)收縮特性，對(duì)于維持正常的肺功能，具有極其重要的作用。應(yīng)用高糖高脂飼料加低劑量鏈脲佐菌素造成大鼠空腹血糖、胰島素水平明顯升高，同時(shí)伴有高血脂，出現(xiàn)類(lèi)2型糖尿病的特征[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的大鼠模型膈肌收縮能力(Pt、P0)和抗疲勞能力(FI)下降和以往的研究結(jié)果類(lèi)似[4]。電鏡檢查也證實(shí)了2型糖尿病大鼠膈肌損傷的存在。

酶是機(jī)體進(jìn)行代謝活動(dòng)所必須的重要物質(zhì)。在呼吸肌，包括CCO、SDH在內(nèi)的眾多酶類(lèi)的正常活性，是維持呼吸運(yùn)動(dòng)的一個(gè)極為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。CCO位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，可以直接將電子傳遞給氧，使氧被激活成氧離子，是呼吸鏈中的最后一個(gè)遞電子體。由于CCO是呼吸鏈的終端，其活性強(qiáng)度直接影響著呼吸鏈傳遞電子的效率，對(duì)于細(xì)胞能量的產(chǎn)生有非常重要的意義。LDH是糖酵解代謝途徑中的關(guān)鍵酶，反映肌肉的無(wú)氧代謝水平。SDH結(jié)合在線(xiàn)粒體內(nèi)膜上，是三羧酸循環(huán)中唯一與內(nèi)膜結(jié)合的酶，其活性標(biāo)志著三羧酸循環(huán)進(jìn)程的快慢，反映對(duì)有氧代謝能力的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病組大鼠膈肌CCO、LDH、SDH活性下降，可能提示2型糖尿病大鼠8周時(shí)膈肌呼吸鏈電子傳遞障礙，糖酵解和有氧氧化代謝能力下降，說(shuō)明糖尿病時(shí)膈肌組織存在能量代謝障礙。電鏡下糖尿病大鼠膈肌主要表現(xiàn)為線(xiàn)粒體擴(kuò)張、嵴變短、空泡化，也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。但沈興平等[7]報(bào)道1型糖尿病大鼠4周時(shí)膈肌SDH活性增強(qiáng)，認(rèn)為糖尿病早期膈肌為適應(yīng)機(jī)體代謝變化，以有氧氧化代謝提供肌肉收縮能量。隨著病程延長(zhǎng)，線(xiàn)粒體損傷的加劇，最終導(dǎo)致SDH活性下降。

GbE是從銀杏科植物銀杏的葉中分離純化的提取物，其主要有效成分為黃酮苷類(lèi)和萜烯內(nèi)酯類(lèi)，具有抗氧化、抗炎、降糖、降脂、改善胰島素抵抗等作用[8]。研究表明GbE能顯著提高骨骼肌的收縮能力，延緩疲勞的發(fā)生[9]。我們前期的研究證實(shí)GbE不僅對(duì)糖尿病大鼠多個(gè)臟器有保護(hù)作用，并減輕膈肌線(xiàn)粒體和心肌組織自由基損傷和抑制NO的產(chǎn)生，從而對(duì)其起到保護(hù)作用[2，10]。本研究結(jié)果提示，GbE能夠增強(qiáng)2型糖尿病大鼠膈肌有氧氧化代謝和糖酵解能力，改善線(xiàn)粒體呼吸鏈的功能，加強(qiáng)膈肌能量供應(yīng)，從而提高膈肌的收縮能力。

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