段文卓，王一鵬，宮海民

(濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部，山東 濰坊 261042)

既往研究大多把硫化氫(H2S)作為一種毒性氣體研究其對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)的毒性作用。近年來發(fā)現(xiàn)含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)在胱硫醚β合成酶(CBS)、胱硫醚γ裂解酶(CSE)催化下產(chǎn)生的H2S是與一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)相似的氣體信號(hào)分子，具有多種生理功能[1]。目前對(duì)H2S的研究主要集中于其作為神經(jīng)調(diào)節(jié)因子及對(duì)心血管系統(tǒng)的作用，還沒有研究涉及到H2S對(duì)凝血相關(guān)系統(tǒng)的調(diào)控。

血小板的L-Arg/NO系統(tǒng)可將L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)入血小板后在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成NO。血小板源性NO具有降低血小板活性、聚集性的作用，可以減少動(dòng)靜脈血栓、及某些心血管疾病的發(fā)生危險(xiǎn)。對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究有助于解釋血栓疾病及心血管急性事件的相關(guān)機(jī)制及致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SD大鼠 30只，雄性，體重(220±15)g，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。L-[2，3，4-3H]Arginine、L-Arginine為 SIGMA公司產(chǎn)品;其余試劑為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)和分組

自大鼠腹主動(dòng)脈取血15 ml，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑體積比9∶1)。離心(200g，15 min)制備富血小板血漿(PRP)，存于4℃，待用時(shí)將PRP置37℃孵育90min。將制備好的PRP分為3組(n=10)，分別為A組:對(duì)PRP進(jìn)行不同濃度條件下血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定;B組:對(duì)PRP進(jìn)行不同孵育時(shí)間條件下血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定;C組:對(duì)PRP進(jìn)行L-Arg酶轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

1.3 血小板孵育

A組PRP用H2S終濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L的Hepes液 37℃孵育 15 min;B 組PRP用H2S終濃度 50μmol/L 的Hepes液37℃分別孵育 1、5、15、30、60min;C 組 PRP 用H2S 終濃度50μmol/L的Hepes液37℃孵育15 min。A、B、C組PRP洗滌1次后將血小板用Hepes液調(diào)整血小板(pt)數(shù)為2×108pt/ml，進(jìn)行L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定。

1.4 L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定

A、B組 PRP分別加入終濃度 50μmol/L3H-LArg37℃孵育5 min;C組PRP分別加入不同濃度3HL-Arg(7.8125 、15.625 、2.5 、31.25 、62.5 、125 、250、500和1000μmol/L)37℃孵育 5 min。A、B 、C 組PRP 分別微孔抽濾裝置過0.45μm孔徑微孔濾膜抽濾，用HEPES液4 ml沖洗3次，晾干濾膜，置于閃爍瓶中，加入閃爍液，同時(shí)設(shè)立不加樣本的非特異平行對(duì)照管，以液閃儀測(cè)定放射活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 H2S孵育濃度對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

H2S表現(xiàn)出對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的明顯抑制作用。H2S濃度為0時(shí)L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)速率為(11.25±0.8776)pmol/(2.0×108plts?min)。H2S濃度12.5μmol/L(H2S 血清生理濃度 50μmol/L)時(shí)抑制作用即具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.868±0.8885 pmol/(2.0×108plts?min)，P＜0.05)，這一效應(yīng)與H2S生理濃度的抑制效應(yīng)相似(P＞0.05，圖1)。由于更高濃度H2S對(duì)細(xì)胞將表現(xiàn)出毒性作用，因此可以認(rèn)為H2S的抑制效應(yīng)并不隨濃度的增加而改變。

Fig.1 Effect of H2S incubation concentration on platelet L-Arg transport(ˉx ± s)

2.2 H2S孵育時(shí)間對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

生理濃度H2S對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的影響與孵育時(shí)間關(guān)系不大，從1 min到60min各組表現(xiàn)的抑制作用相似(P＞0.05，圖2)。

Fig.2 Effect of 50μmol/L H2S incubation time on platelet L-Arg transport()

2.3 H2S對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

相對(duì)于 control組 ，生理濃度(50μmol/L)H2S 可以顯著降低血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的Vmax(H2S 33.40±2.548 pmol/(2.0×108plts?min);control(61.20±4.454)pmol/(2.0×108plts?min)，P ＜0.05)，但對(duì)米氏常數(shù)(Km)無(wú)明顯影響(H2S 303.8±56.29μmol/L;control(325.4±56.31)μmol/L，P ＞0.05，圖3)，提示H2S對(duì)L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)存在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

Fig.3 Effect of 50μmol/L H2S on platelet L-Arg transport curve(ˉx ± s)

3 討論

血小板的L-Arg/NO系統(tǒng)的主要作用是將血漿L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)入血小板，在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成NO。血小板源性NO，通過激活血小板鳥苷酸環(huán)化酶，使血小板內(nèi)cGMP含量升高，從而抑制了血小板的粘附與聚集功能[2]。冠心病、中風(fēng)、動(dòng)靜脈血栓等疾病的發(fā)病在很大程度上與體內(nèi)血小板狀態(tài)有關(guān)。當(dāng)血小板源性NO不能及時(shí)生成時(shí)，缺乏自身調(diào)節(jié)能力的血小板將很容易出現(xiàn)功能障礙。已知多種心血管疾病危險(xiǎn)因素可抑制血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)及NOS活性，造成血小板源性NO生成不足，并繼而引起心腦血管疾病的發(fā)病。

H2S主要來源于含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)在CBS、CSE催化下產(chǎn)生，在體內(nèi)主要有兩種存在形式:氣體分子H2S形式占1/3;硫氫化鈉(NaHS)形式占2/3?，F(xiàn)有研究表明生理濃度的H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有生理調(diào)節(jié)功能，其功能包括調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)與記憶[3]、降低組織與細(xì)胞有氧氧化水平[4]、激活血管平滑肌KATP通道造成血管舒張[5]等。另有研究表明H2S與NO的關(guān)系密切，在心血管系統(tǒng)H2S與NO之間互相存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[6]，但在凝血/抗凝系統(tǒng)二者關(guān)系尚不清楚。

大鼠血清的H2S生理濃度為(45.6±14.2)μmol/L，本次研究使用與生理濃度相近的H2S氣體溶液對(duì)血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的影響評(píng)價(jià)H2S對(duì)血小板的生理調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H2S可以快速的抑制血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，這一抑制作用在較低濃度下即可實(shí)現(xiàn)，而轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)結(jié)果提示H2S對(duì)L-Arg在血小板的轉(zhuǎn)運(yùn)具有非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用。這種效應(yīng)可以迅速的造成血小板內(nèi) L-Arg的儲(chǔ)備降低，生理情況下這一改變或許對(duì)機(jī)體凝血抗凝平衡的改變并不明顯，但在某些病理狀況下造成血小板源性NO生成不足從而加重疾病表現(xiàn)甚至引發(fā)新的病變。

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[2]王榮花，張寶娓，唐朝樞.紅細(xì)胞與血小板的L-精氨酸/NO系統(tǒng)在心血管疾病中的變化[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2003，24(4):243-247.

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