陳 悅，徐 曉，魯 穎

(河南大學醫(yī)學院生理學教研室，開封 475004)

葛根系豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根素(puerarin，Pur)是從其干燥根中分離出來的單體，化學名為4，7-二羥基 8-β-D 葡萄糖異黃酮(4H-1-Benzopyran-4-one，8-B-D-glucopyranosyl-7-hydroxy 3-4-hydroxyphenyl)。由于其化學成分具有獨特的生物活性，備受醫(yī)學界關(guān)注。Pur對心血管系統(tǒng)的作用已經(jīng)得到證實[1]，但Pur究竟是通過何種途徑發(fā)揮作用，具體機制尚未完全明了。本實驗用常規(guī)微電極方法和全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察并記錄葛根素對大鼠心室肌動作電位和心室肌細胞鉀離子流的影響，以探討Pur抗心律失常的電生理機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

體重200～230g大鼠，雌雄不限，鄭州大學實驗動物中心提供。臺氏液成分(mmol/L):NaCl 143.0，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl20.5，NaHCO323.8，NaH2PO40.3，glucose 10，95%O2和5%CO2飽和，pH 7.3。無鈣臺氏液(mmol/L):NaCl 100，KCl 10，MgSO45.0，glucose 20，taurine 10，MOPS 10，用KOH將pH調(diào)至7.3。葛根素注射液，安徽同仁藥業(yè)有限公司出品，批號H20045081。膠原酶Ⅱ，Taurine，MOPS，HEPES，Tris-GTP，EGTA，均購自Sigma公司。TTX，大連瑞芳生物物品有限公司。其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌細胞動作電位記錄 將大鼠擊昏后，速取心臟置于37℃95%O2和5%CO2飽和臺氏液中，分離出心室肌用0號不銹鋼針固定于恒溫(36±0.5)℃、恒流(5 ml/min)灌流槽底部。以直徑0.5 mm不銹鋼電極作細胞外刺激。用微操縱儀將電極插入心室肌細胞，待放大器上顯出電位-70～-90mV即為靜息電位，然后用刺激器經(jīng)刺激隔離器輸出波寬5 ms、頻率1 Hz、強度為閾值的1.5倍的刺激。記錄電極為充3mmol/L KCl的玻璃電極，電阻為10～15 MΩ，插入到細胞內(nèi)引出動作電位，信號經(jīng)微電極放大器放大后輸入雙線示波器中，同時經(jīng)BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)輸入計算機中，用MCP2000程序顯示、處理分析。

1.2.2 大鼠心室肌細胞分離 將大鼠擊昏后，速取心臟置于4℃MOPS液中(3-(N-嗎啉基)丙磺酸緩沖液，MOPS BUFFER)，去除周圍結(jié)締組織。將心臟連于Langendorff灌流裝置上，經(jīng)主動脈逆向灌流。先用無鈣MOPS液灌流5 min，然后用含50μmol/L Ca2+和0.035%膠原酶Ⅱ、1% 牛血清白蛋白的MOPS液灌流5 min取下心臟，剪去心房，在含有100μmol/L Ca2+和1% 牛血清白蛋白的MOPS液中剪碎、吹打、溫孵10min，尼龍網(wǎng)過濾，將細胞懸液的鈣濃度提高到1μmol/L，室溫保存。灌流液用100%的O2飽和，灌流系統(tǒng)的溫度保持在37℃。

1.2.3 大鼠心室肌細胞通道電流的記錄 用膜片鉗全細胞記錄法，在電壓鉗制下記錄IK1。在室溫25℃下吸取上述細胞懸液1滴入細胞浴槽中，置于倒置顯微鏡(Olympus lX70，japan)工作臺上，待細胞貼壁后，用不同的灌流液持續(xù)灌流，流速2 mmol/L。選擇橫紋清晰、無收縮的細胞使用，微操縱器使阻抗為2～4MΩ、充滿電極內(nèi)液的玻璃微電極與細胞表面形成巨阻抗封接，然后擊破細胞膜，補償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細胞記錄。信號經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗放大器(Axopatch 2008，USA)放大，經(jīng)電腦運行pClamp 6.0.3)程序(Axon lnstru ments，USA)通過A/D、D/A轉(zhuǎn)換(Digidata 1200serious interface，USA)控制刺激的發(fā)放和信號采集。電流經(jīng)1 Hz濾波后儲存于計算機硬盤中。

1.2.4 檢測指標 測定動作電位的各項參數(shù) 靜息電位(resting potential，RP)、動作電位幅度(action potential amplitude，APA)、最大去極化速率(maximum，Vmax)、動作電位復(fù)極至50%、90%(action potential duration，APD50、APD90)的時間 。離子通道電流以正常細胞外液記錄的電流鋒值為100%，加藥后的電流為正常電流的百分數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的葛根素對大鼠心室肌細胞動作電位的影響

在臺氏液中記錄到動作電位后，穩(wěn)定0.5 h，把0.005、0.01、0.015 mmol/L Pur分別加入到灌流液中，灌流 30min。結(jié)果顯示:不同濃度Pur對大鼠 RP、APA、Vmax的影響沒有統(tǒng)計學意義，但均能延長APD50、APD90，從而影響動作電位時程，且隨著濃度的增大而增加(P＜0.05，P＜0.01，表1)。

Tab.1 Effects of the different concentration pur on action potential in rat myocardium(，n=6)

Tab.1 Effects of the different concentration pur on action potential in rat myocardium(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group RP/mV APAmV VmaxV/s APD50/ms APD90/ms Control -89.8±3.4 110.7±8.7 228.3±13.1 14.7±2.3 68.6±8.7 Pur(mmol/L)0.005 -87.1±2.3 112.6±9.3 234.4±16.2 17.6±3.8* 76.3±11.4*0.01 -85.9±2.7 109.9±6.1 237.2±18.6 29.7±4.9** 93.0±13.7**0.015 -71.7±3.1 108.2±29.4 236.6±19.4 40.8±5.4** 127.2±18.4**

2.2 不同濃度的葛根素對大鼠心室肌內(nèi)向整流鉀電流的影響

臺氏液中1μmol/L Nifedipine阻斷Ica-L，加20μmol/L TTX阻斷INa，常規(guī)電壓鉗下，保持電壓-40mV，鉗制電壓-120mV、持續(xù)500ms、階躍10mV、刺激頻率0.2Hz的去極化脈沖引出。灌流液中分別加入0.005、0.01、0.015 mmol/L Pur，記錄不同鉗制電壓下心肌細胞的IK1。結(jié)果顯示，不同濃度的Pur均能抑制不同去極化水平的 IK1，0.005 mmol/L Pur對IK1抑制率為18.6±2.1%(P＜0.05)、0.015 mmol/L Pur對IK1抑制率達到56%±1.8%(P＜0.01)并呈量效關(guān)系(圖 1見下頁)。

3 討論

Fig.1 Effects of the different concentration pur on IK1in rat myocardium

大鼠心肌細胞電生理特點與人相似[2，3]，本實驗用常規(guī)微電極方法和膜片鉗技術(shù)記錄Pur對大鼠心室肌細胞AP、IK1的影響，以探討Pur抗心律失常的作用機理。本研究給藥前鉗制電位為-120～-60mV時，IK1為內(nèi)向電流，當膜電位去極一外向電流減小，因此認為記錄到的電流為IK1[4]。動作電位3相快速復(fù)極化過程中，IK1為外向電流，其可促進晚期復(fù)極[5]。用藥物抑制IK1這一外向電流，將抑制細胞復(fù)極化從而延長動作電位時程。IK1通道在靜息電位-90mV下不易誘發(fā)心室肌細胞IK1的內(nèi)向電流，因此本研究保持電位-40mV，-120mV鉗制電壓下記錄葛根素對IK1的影響。實驗結(jié)果顯示:不同濃度的Pur能延長心室肌細胞APD50、APD90，可能是通過減少內(nèi)向整流鉀電流實現(xiàn)的，這也可能是Pur延長大鼠心室肌動作電位時程的機理之一。由于心肌細胞動作電位是由多種離子流構(gòu)成，因此還需研究Pur對其它離子流的影響才能得到Pur抗心律失常完整的結(jié)論。

[1]王永霞，何立人.葛根素的心血管系統(tǒng)藥理作用及機理研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2004，38(4):1-3.

[2]He J Y，KargacinM E，Kargacin G J，et al.Tamoxifeninhibits Na+and K+current at ventricular myocytes[J].AmJ Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):661-668.

[3]Bryant S M，Shipsey S J，Hart G.Normal regional distribution of membrane current density in rat left ventricle is altered in cate-cholamine-induced hypertrophy[J].Cardiovasc Res，1999，42(2):391-401.

[4]黃愛杰，李立環(huán)，陳 雷，等.氯胺酮對離體大鼠心室肌細胞內(nèi)向整流鉀電流的影響[J].中華麻醉學雜志，2006，26(1):46-48.

[5]張 華，馬蘭香，楊星昌，等.葛根素對大鼠心肌細胞離子通道的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報，2006，27(3):249-251.