謝 露，王麗萍，陳蒙華，黎 靜

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管病研究所，南寧 530021)

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與血管組織間的一道半通透屏障，具有非常重要的保護(hù)和分泌調(diào)節(jié)功能，如維持血管內(nèi)皮依賴性舒張活性，調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張，維持凝血和抗血栓功能的平衡，使血管內(nèi)膜表面無血栓形成。內(nèi)皮細(xì)胞受損會(huì)引起上述生理作用減弱或喪失，因此，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損害或逆轉(zhuǎn)或改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在血栓性疾病的防治中具有重要意義。我們通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖(PL)L01對(duì)大劑量腎上腺素引起的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，從而保護(hù)其抗血栓功能【1】。本研究通過觀察腎上腺素對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical venousendothelial cell，HUVEC)超微結(jié)構(gòu)的損害及海帶多糖的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞株購于上海午立公司，由本研究室自行傳代。腎上腺素注射液(廣州明興制藥廠)。DMEM培養(yǎng)基干粉(Gibco公司)。小牛血清(杭州四季清生物工程公司)。胰蛋白酶(DIFCO公司)。3111CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)。1450超凈工作臺(tái)(蘇州市黃浦空調(diào)凈化設(shè)備有限公司)。XSB-1A倒置顯微鏡(梧州光學(xué)儀器廠)。BD-211電子天平(SATORIOUS，德國)。日立H500型投射電鏡(日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 海帶多糖制劑 海帶干粉，加水調(diào)漿，先經(jīng)纖維素酶和中性蛋白酶水解，后經(jīng)鹽酸浸泡、乙醇沉淀得海帶多糖粗品。粗品經(jīng)DEAE-纖維素柱分離得到含量最高的組分。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 取HUVEC細(xì)胞株(4～10)×104cells/ml接種于D MEM培養(yǎng)基(含 10%小牛血清，青、鏈霉素各100U/ml)中，置5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換半液，生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。將HUVEC用0.25%胰蛋白酶消化，以5×104cells/cm2密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后換液，分組:正常組(不加藥物)、Adr組(10μg/ml Adr)、PL 組(0.1 mg/ml PL)、低劑量PL(L-PL)+Adr組(0.01 mg/ml PL+10μg/ml Adr)，高劑量 PL(H-PL)+Adr組(0.1 mg/ml PL+10μg/ml Adr)。每組8孔。

1.2.3 電鏡標(biāo)本的制備 HUVEC接種后24h棄去培養(yǎng)液，用低濃度胰酶消化，移入離心管，1000～1500r/min離心5～10min，吸棄上清液，加入胎牛血清 1滴，然后吹散離心物使其混合，再離心3～5 min，吸棄上清。用 2%戊二醛固定后，再用鋨酸固定。梯度乙醇脫水，Epon 812樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙染色，日立H500透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下各組HUVEC細(xì)胞核形態(tài)

正常組細(xì)胞核類圓形，核膜完整，核仁圓潤、清晰。Adr組細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核表面呈現(xiàn)多處突出或向內(nèi)凹陷，核仁固縮、邊界模糊。PL組和H-PL+Adr組細(xì)胞核形態(tài)與正常組比較無明顯改變。L-PL+Adr組細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，表面有凹陷，核仁固縮，但邊界清晰(圖1)。

2.2 電鏡下各組HUVEC線粒體形態(tài)

正常組線粒體結(jié)構(gòu)完好，嵴清晰可見。Adr組線粒體腫脹，嵴消失，空泡化。PL組和H-PL+Adr組線粒體形態(tài)與正常組比較無明顯改變。L-PL+Adr組線粒體無腫脹，嵴依稀可見，內(nèi)有空泡(圖2)。

Fig.1 Electron micrograph of HUVEC in five groups showing nuclear contour(×2.8 k)

Fig.2 Electron micrograph of HUVEC in five groups showing mitochondria contour(×3 k)

3 討論

我們實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Adr與HUVEC共培養(yǎng)后，對(duì)細(xì)胞核和線粒體的損害明顯，這與其代謝產(chǎn)物的毒性作用有關(guān)。Adr可在A型單胺氧化酶作用下，脫氨生成甲胺，后者在氨基脲敏感胺氧化酶作用下生成甲醛、過氧化氫和氨，這三種產(chǎn)物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性【2，3】。細(xì)胞核和線粒體損傷將使內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝、活性物質(zhì)表達(dá)發(fā)生嚴(yán)重障礙，失去其原有的生理功能。實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)加入PL，對(duì)HUVEC超微結(jié)構(gòu)無明顯影響，加入PL+Adr后，HUVEC超微結(jié)構(gòu)改變情況與PL劑量相關(guān)，L-PL+Adr組的細(xì)胞核形態(tài)明顯變形，線粒體內(nèi)有空泡，而H-PL+Adr組細(xì)胞核和線粒體結(jié)構(gòu)都完好，說明 PL能夠拮抗Adr和(或)脫氨產(chǎn)物對(duì)HUVEC細(xì)胞核、線粒體超微結(jié)構(gòu)的損害。

我們?cè)谇耙浑A段的研究中發(fā)現(xiàn)海帶多糖能夠拮抗注射Adr引起的大鼠內(nèi)皮損傷，形態(tài)學(xué)觀察可見，給藥組內(nèi)皮細(xì)胞脫落、損失較輕，完整內(nèi)皮長(zhǎng)度明顯大于模型組【1】。在本研究中，我們深入觀察Adr對(duì)HUVEC的超微結(jié)構(gòu)的損害及海帶多糖的保護(hù)作用，結(jié)果進(jìn)一步說明了海帶多糖能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，因此可維護(hù)其調(diào)節(jié)血管張力、止血與抗凝血平衡等正常生理功能。海帶多糖是否能夠減少Adr代謝產(chǎn)物生成或是能夠阻止代謝產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用?其作用機(jī)理還有待于探討。

[1]謝 露，劉愛群，黎 靜，等.海帶多糖對(duì)腎上腺素致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2007，23(2):143-146.

[2]Boor P，Trent M B，Lyles G A，et al.Methylamine metabolism to formaldehyde by vascular semicarbazide-sensitive amine oxidase[J].Toxicol，1992，73(3):251-258.

[3]Yu P H，Lai C T，Zuo D M.Formation of formaldehyde from adrenaline invivo;a potential risk factor for stress-related angiopathy[J].Neurochem Res，1997，22(5):615-620.