熊 浩，崔 雯，王杏龍，劉 翔

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 225009）

哺乳動物原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells,pGGs）在一定條件下維持未分化狀態(tài)，經(jīng)過體外長期培養(yǎng)可以建立胚胎性干細(xì)胞系，稱為EGCs，這也是另一來源的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）。PGCs用于 ESCs的分離與克隆始于1992年，Matsui等［1］對小鼠PGCs長期培養(yǎng)，建立了EGCs系，此后，用PGCs分離與克隆ESCs又在大鼠、豬、牛、山羊等動物上取得重要進(jìn)展。但是目前只在小鼠上成功建系，而在其他物種上成功建系的卻不多，尤其在國內(nèi)，從山羊PGCs來源培養(yǎng)出長期穩(wěn)定增殖的ESCs并且建系成功的報道至今未見。本實驗從本地白山羊的早期胎兒生殖嵴中分離PGCs，將PGCs進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，從而得到ESCs，將其在不同的條件下培養(yǎng)，初步分析了各種不同條件對培養(yǎng)效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：高糖DMEM、非必需氨基酸（non-essential amino acid）：Gibco 公司；LIF、SCF：Sigam 公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青公司；L-谷氨酰胺（L-glutamine）、胰蛋白酶（trypsinase）、牛血清白蛋白（BSA）、膠原酶（collagenase）：上海生工生物工程有限公司。

成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液+10%FBS+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+2 mmol/L L-谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉+100 u/mL青鏈霉素。

ESCs培養(yǎng)液：DMEM 培養(yǎng)液+15%FBS+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+2 mmol/L L-谷氨酰胺+0.01 mM非必需氨基酸+1 mmol/L丙酮酸鈉+100 u/mL青鏈霉素+不同濃度的各種細(xì)胞因子。

細(xì)胞凍存液：80%的DMEM培養(yǎng)液+10%的FBS+10%的DMSO，短期4℃低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的制作（GEF） 本地白山羊早期胎兒從江蘇省丹陽市珥玲山羊交易市場收集。要求收集到的子宮表面無嚴(yán)重污染。如果直接從山羊體內(nèi)獲取子宮，則迅速投入到4℃含有200 u/mL的青鏈霉素的生理鹽水中；如果從屠宰后的廢棄內(nèi)臟中獲取子宮，則以碘酊和75%的乙醇先后擦拭凈子宮表面，以除去覆蓋的異物，再以生理鹽水沖洗子宮表面，然后剪開子宮取出胎兒（不能剪破羊膜），迅速投入到4℃的生理鹽水中，收集完后帶回實驗室。參考王國云等［2］制作小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的方法制作GEF，于38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 飼養(yǎng)層的制作 選取剛好鋪滿瓶底，生長良好的2～4代成纖維細(xì)胞制備飼養(yǎng)層。

1.2.3 山羊原始生殖細(xì)胞的培養(yǎng) 取材方法與上同。在體視顯微鏡下無菌剝離胎兒生殖嵴及其周圍的復(fù)合物，充分剪碎，室溫（25℃）下在組織塊中加入消化液，邊消化邊用移液器不停的吹打。以等體積的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中止消化，搖勻，100目紗網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去掉上清液，再加入ESCs培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為105個/mL，于38.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞生長狀況，更換培養(yǎng)液以去除死細(xì)胞，以后待發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃時便換液。PGCs集落周圍出現(xiàn)分化細(xì)胞之前應(yīng)立即進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件同上。

1.2.4 試驗設(shè)計

1）參照文獻(xiàn)［3］給山羊胎兒分類的方法，取胎兒冠臀長15～30 mm的胎兒。試驗設(shè)計2）～4）均采用冠臀長為15～30 mm的胎兒，室溫（25℃）下消化15 min，在原代培養(yǎng)中使用不同濃度的消化液：0.25%胰酶+0.04%EDTA和0.125%胰酶+0.02%EDTA，比較兩種消化方式對原代集落形成的影響。

2）使用以下兩種方法進(jìn)行傳代

方法一：將觀察到的典型集落的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸去，然后以細(xì)玻璃針挑出集落，無菌條件下以細(xì)針離散集落塊，移入離心管中，加入適量的0.05%的胰酶，以移液器吹打2～3 min，再加入ESCs培養(yǎng)液，然后再接種于飼養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)。

方法二：將觀察到的典型集落與飼養(yǎng)層在0.125%胰酶+0.02%EDTA一起消化，顯微鏡下觀察到集落開始逐漸散開時立即以等體積含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，吹打搖勻，1 000 r/min離心5 min，去上清液，加入ESCs培養(yǎng)液，先將細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)瓶中，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 min，然后小心傾斜培養(yǎng)瓶，倒出培養(yǎng)液于飼養(yǎng)層上，這樣可以除去一部分貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于新的飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。

比較兩種不同傳代方式對細(xì)胞傳代的影響。

3）以第一步實驗為結(jié)果，選取最好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)方式，然后在培養(yǎng)基中添加不同濃度的因子：①LIF：10 ng/mL;②LIF：20 ng/mL;③LIF（10 ng/mL）+SCF（10 ng/mL）；④LIF（20 ng/mL）+SCF（20 ng/mL），比較不同培養(yǎng)方式下原代和傳代培養(yǎng)的效果。

4）選取冠臀長小于15 mm胎兒和大于30 mm的胎兒進(jìn)行培養(yǎng)，比較以這兩種冠臀長的胎兒為材料培養(yǎng)PGCs的效果。

1.2.5 AKP染色鑒定 室溫下，吸去培養(yǎng)液，以PBS溶液清洗3次；以4%多聚甲醛固定10 min（此時配制顯色液：向 1mL超純水中加入一滴 A（NBT）和 B（BCIP）液，混勻后靜置）；吸去多聚甲醛，加入適量的顯色液，暗室放置10～30min，期間觀察，以便拍出不同的顯色效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGCs的生長 剛分離的PGCs在體外培養(yǎng)時，開始培養(yǎng)的初期是處于游離期的。24 h以后可見小的集落形成，72 h后就可以見到明顯的集落形成。山羊PGCs呈山苞狀、鳥巢狀和島狀，形態(tài)不規(guī)則，凸起于成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層之上，集落與周圍的成纖維細(xì)胞聯(lián)系較為緊密，集落內(nèi)的細(xì)胞間隙不明顯。傳代后即EGCs，山羊EGCs在24～48 h內(nèi)也會形成小的集落，培養(yǎng)到約72 h后可見明顯的集落形成，與ESCs的生長行為類似，培養(yǎng)到5～6 d后在顯微鏡下可見到很典型的克隆突出于飼養(yǎng)層表面，與PGCs具有相似的形狀。

2.2 不同胰酶濃度的消化對原代集落和傳代的影響 以0.25%胰酶+0.04%EDTA和0.125%胰酶+0.02%EDTA兩種濃度消化液進(jìn)行消化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在室溫下消化15 min的時候，前者消化得到的原代集落的形成率較高（120%），而后者的消化的效果不好（25%），傳代數(shù)也低于前者，兩者差異顯著（P＜0.05）。

圖1 山羊原始生殖細(xì)胞（GEF飼養(yǎng)層）100×

圖2 山羊胚胎生殖細(xì)胞（GEF飼養(yǎng)層） 200×

表1 不同胰酶濃度的消化對原代集落和傳代的影響

2.3 不同傳代方式對傳代的影響 以結(jié)果2.2中的原代集落為樣本，以兩種方式進(jìn)行傳代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是挑取集落傳代還是以0.125%胰酶+0.02%EDTA消化傳代，均能將PGCs傳至2代。第1代集落的形成率分別為42.9%和57.1%，第2代集落形成率分別為14.3%和28.6%，結(jié)果表明兩者無顯著差異（P＞0.05），在本次試驗中兩種傳代方式都適合于PGCs的傳代培養(yǎng)。

表2 不同傳代方式對傳代的影響

2.4 不同種類和濃度的細(xì)胞因子對PGCs原代和傳代的影響 在培養(yǎng)液中添加不同種類和濃度的因子，以GEF為飼養(yǎng)層培養(yǎng)，結(jié)果如表3所示，統(tǒng)計每組每次形成的集落個數(shù)，每個組重復(fù)3次。結(jié)果顯示，無論使用LIF還是LIF+SCF都可以使PGCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)，而增加兩種細(xì)胞因子的濃度似乎與原代和傳代培養(yǎng)的效果無關(guān)，兩者差異不顯著（P＞0.05），且均能將原代集落培養(yǎng)至第2代。

表3 不同種類和濃度的細(xì)胞因子對PGCs原代和傳代的影響

2.5 不同胎齡段山羊PGCs培養(yǎng)的效果 本次試驗采用冠臀長小于15 mm和大于30 mm的胎兒進(jìn)行培養(yǎng)，如表4。采樣4個胎兒為冠臀長小于15 mm，只有1個原代集落形成，且沒有能夠傳代；而采樣的6個冠臀長大于30 mm的胎兒中沒有形成原代集落，試驗結(jié)果也證實了只有冠臀長在15～30 mm的胎兒的生殖嵴適合于培養(yǎng)PGCs。

表4 不同胎齡段山羊PGCs培養(yǎng)的效果

2.6 山羊PGCs的鑒定 AKP染色鑒定結(jié)果如圖3、圖4。PGCs和EGCs被染成紅棕色，與ESCs染色結(jié)果一樣呈陽性。

圖3 AKP染色的PGCs（GEF飼養(yǎng)層）100×

圖4 AKP染色的第2代EGCs 100×

3 討論

3.1 細(xì)胞因子的影響 在從PGCs中分離ESCs時，多數(shù)學(xué)者不但使用了飼養(yǎng)層，同時還在培養(yǎng)液中添加各種細(xì)胞因子，細(xì)胞因子一方面抑制ESCs的分化（分化抑制因子），另一方面刺激細(xì)胞的分裂增殖（生長因子）。李松[4]研究發(fā)現(xiàn)，采用牛PGCs與其胎兒成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的方式添加細(xì)胞因子與否對牛PGCs分離的影響并不顯著，而傳代過程中則最好添加因子，培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子與否對PGCs的原代集落形成和傳代有重要影響，可能是飼養(yǎng)層分泌的因子遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能維持PGCs的生存和未分化狀態(tài)，必須要添加外源因子。葛秀國等［5］以3個不同質(zhì)量濃度LIF的培養(yǎng)液培養(yǎng)PGCs，在原代培養(yǎng)時，效果差異不顯著（P＞0.05）；而在傳代過程中，以含LIF 10 ng/mL組培養(yǎng)效果最好，但與含LIF 5ng/mL組差異不顯著（P＞0.05），而LIF 1 ng/mL組培養(yǎng)效果較差（P＜0.05）。楊麗芬［6］研究結(jié)果為，添加LIF+SCF后EGCs的克隆代數(shù)高于單獨(dú)添加LIF，培養(yǎng)效果較好。本研究在培養(yǎng)液中添加LIF+SCF，與單獨(dú)添加LIF比較，對培養(yǎng)效果也沒有顯著影響（P＞0.05），即使增加這兩種因子的濃度，差異也不顯著（P＞0.05），這可能是LIF是PGCs生長和維持未分化狀態(tài)最重要的細(xì)胞因子，并不是因子種類越多，濃度越大就會使得PGCs的原代集落增多和傳代次數(shù)增加。

3.2 不同消化方式對PGCs分離培養(yǎng)的影響 現(xiàn)在大多數(shù)采用的是胰酶+EDTA消化再以輔助吹打分離得到PGCs。許新［7］在37℃下，使用0.02%EDTA消化包含PGCs的組織15 min，然后再用吸管輕輕吹打來獲得PGCs。李松［4］以0.2%胰酶+0.04%EDTA的消化液綜合作用，對分離牛PGCs的效果好。本試驗在室溫下，以0.125%胰酶+0.02%EDTA消化效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于0.25%胰酶+0.04%EDTA，以0.25%胰酶+0.04%EDTA消化方式消化組織，細(xì)胞活率較低，這種消化方式下細(xì)胞死亡較多，培養(yǎng)時形成的集落會少，且無法得到傳代的集落。以0.125%胰酶+0.02%EDTA來消化組織，再輔以機(jī)械吹打便可得到較多的原代集落，細(xì)胞活率較高。

3.3 傳代方式對集落形成的影響 楊煒峰［3］研究表明，機(jī)械法（輔助酶消化法）可以獲得較高的山羊PGCs的傳代數(shù)。本試驗采用挑取集落法和胰酶消化法兩種方法，結(jié)果顯示兩種傳代方法對傳代數(shù)和新集落形成率沒有顯著差異（P＞0.05），第一種方法能較好分散開細(xì)胞塊；第二種方法只要掌握好胰酶的作用濃度和作用的時間，也有利于新集落的形成和傳代。在實際操作中，要根據(jù)不同的集落生長狀況以及各個實驗室的條件選擇適應(yīng)的傳代方法，或者同時使用幾種方法，才能提高傳代效率和得到較好的新集落。

3.4 胎齡的影響 用于分離培養(yǎng)PGCs的胎兒的胎齡是有一定限制的，不同胎齡段的胎兒分離培養(yǎng)PGCs的效果也不同。Lee等［8］從25 d山羊胎兒分離得到PGCs，Kuhholzer等［9］用32 d山羊胎兒分離建立了 PGCs系。韓建永等［10］從44 d山羊胎兒生殖嵴中分離得到PGCs。楊煒峰［3］研究結(jié)果顯示胎兒胎齡大于45 d（冠臀長大于30 mm）的胎兒也可以得到PGCs。本試驗由于胎兒全部取自屠宰場，沒有系統(tǒng)的白山羊資料記載，所以只能以胎兒冠臀長來進(jìn)行分類。臀長小于15 mm的胎兒，僅得到1個原代集落，這可能是由于胎齡過小，雖然PGCs分化程度低，越具有多能性，但是其中PGCs含量過少，或者PGCs還未完全遷移至生殖嵴中；冠臀長大于30 mm的胎兒，沒有得到原代的克隆集落，這可能是由于胎齡過大，此時生殖嵴已經(jīng)發(fā)育成為性腺，大部分的PGCs轉(zhuǎn)化為性原細(xì)胞，從而無法獲得集落，在試驗過程中還觀察到此胎齡段的胎兒組織塊不易消化，消化時間太短無法離散組織，消化時間太長又對細(xì)胞造成傷害，影響細(xì)胞活力。

3.5 其它因素的影響 本試驗中PGCs傳至第2代后大多數(shù)凋亡或者發(fā)生分化，無法繼續(xù)傳代。原因可能有以下幾個方面：

采集的胎兒全部來自于屠宰場，從屠宰地點收集胎兒運(yùn)輸?shù)綄嶒炇液馁M(fèi)的時間比較長，基本上需要8 h，而且在收集樣品時，大多數(shù)胎兒脫離母體的時間已經(jīng)較長了，雖然在運(yùn)輸過程中采用低溫保存，盡可能地抑制細(xì)胞的代謝活動，但到達(dá)實驗室時胎兒死亡的時間已經(jīng)較長了，所以部分細(xì)胞可能在運(yùn)輸過程中發(fā)生死亡，從而導(dǎo)致PGCs形成原代集落較少。

培養(yǎng)基中添加成分的影響。培養(yǎng)基中的血清質(zhì)量好壞最直接影響到ESCs的培養(yǎng)效果。血清促進(jìn)細(xì)胞增殖的主要原因是：血清中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)及促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子。但是血清也含有很多不確定成分，這些成分有可能誘導(dǎo)ESCs分化。在ESCs培養(yǎng)過程中還要選擇適宜的血清濃度，過高或者過低都不利于ESCs的克隆和增殖，而且在細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)該一直采用同一廠家和同一批次的血清。近年來有實驗室使用KSR培養(yǎng)ESCs，取得了良好的效果。一般培養(yǎng)ESCs細(xì)胞在培養(yǎng)基中還需添加L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、細(xì)胞因子、抗生素等成分，由于這些成分和血清一樣來自不同的廠家和不同的批次，其純度也不盡相同，其中也有可能含有對ESCs促進(jìn)分化的因子，所以這些因素也會對PGCs集落形成和傳代造成影響。

4 結(jié)論

本試驗采用本地白山羊胎兒生殖嵴為材料，以GEF為培養(yǎng)層，在培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子，使用0.125%胰酶+0.02%EDTA傳代，無論以挑取集落傳代還是以胰酶消化傳代均能將PGCs傳至第2代。

［1］Matsai Y，Zsebo K，Hogan B.Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture cell［J］.Cell，1992，70（5）：841-847.

［2］王國云，李棟，張輝，等.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層制備條件的研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，43（5）：396-400.

［3］楊煒峰.山羊胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

［4］李松.從原始生殖細(xì)胞中分離克隆牛胚胎干細(xì)胞［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2001.

［5］葛秀國，華進(jìn)聯(lián)，楊繼建.山羊原始生殖細(xì)胞的分離與培養(yǎng)［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)：自然科學(xué)版，2005，33（2）：27-31.

［6］楊麗芬，王清華，項智鋒，等.不同因素對山羊原始生殖嵴細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與克隆的影響［J］.中國畜牧雜志，2007，43（19）：20-23.

［7］許新，叢笑倩.小鼠原生殖細(xì)胞建系過程及其分化特性的研究［J］.實驗生物學(xué)報，1999，32（3）：251-263.

［8］Lee S L，Tourtelltte L C，Wesselschmidt R L，et al.Growth and differentiation proceeds normally in cells deficient in the immediate early gene NGF1-A［J］.J Boil Chem，1995，270：9971-9977.

［9］Kuhholzer B，Baguisi A，Overstrom E W.Long-term culture and characterization of goat primordial germ cells［J］.Theriogenology，2000，53（5）：1071-1079.

［10］韓建永，桑潤滋，孫國杰，等.山羊PGCs用于分離與克隆類ES細(xì)胞［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2002，22（4）：344-347.