束曉梅 王曉紅 彭 昌 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,遵義 563003)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)感染與自身免疫性周圍神經(jīng)病——Guillain-Barre綜合征(GBS)關(guān)系密切,但機制不清[1]。CJ的脂寡糖(lipooligosaccharide,LOS)結(jié)構(gòu)上存在多種神經(jīng)節(jié)苷脂樣結(jié)構(gòu),可能通過分子模擬發(fā)生周圍神經(jīng)免疫性損傷。waaF基因編碼庚糖轉(zhuǎn)移酶,催化轉(zhuǎn)移庚糖連接到LOS外核上。理論上說,waaF基因敲除后,變異株丟失LOS上所有的神經(jīng)節(jié)苷脂表位[2],即 waaF變異株不含有模擬神經(jīng)節(jié)苷脂樣結(jié)構(gòu),不能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生神經(jīng)節(jié)苷脂抗體及免疫性周圍神經(jīng)損傷。我們用Benjamin博士饋贈的 waaF基因敲除變異株,對照親代株研究兩者誘導(dǎo)動物抗體產(chǎn)生及周圍神經(jīng)損傷的改變,對進一步證實 CJ誘發(fā)GBS的分子模擬理論及探索waaF變異株作為減毒活菌苗的可能性具有十分重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 CJ親代株(菌號HB9313,血清型HS:19)及其waaF變異株由澳大利亞皇家墨爾本研究所Benjamin N Fry博士饋贈。神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GD1a、GD1b、GD3、GT1b 及辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體購自Sigma公司,親代株(HB9313)的LOS由本實驗室純化,經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度達到95%。3月齡日本大耳兔由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,體重2～2.5千克,雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1 滅活CJ菌液制備 兩菌株均微需氧環(huán)境,42℃生長于Skirrow培養(yǎng)基中,變異株需加入終濃度為0.03 μ g/L的卡那霉素。用含甲醛0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)滅活,3 500 r/min離心30分鐘,9 g/L鹽水洗滌沉淀物2次,3 500 r/min室溫離心10分鐘,棄上清液,調(diào)至終濃度為3×1012CFU/L的滅活菌液備用。

1.2.2 實驗動物分組 日本大耳兔26只,隨機分為3個實驗組:親代株組(10只)、waaF變異株組(10只)及對照組(6只)。

1.2.3 免疫方法 初次免疫:取完全弗氏佐劑分別與等體積的親代株菌液、變異株菌液、9 g/L鹽水溶液混勻充分乳化后,以每只兔總量2 ml,背部皮下多點注射;加強免疫:分別在初次免疫后2周、3周時,取不完全弗氏佐劑與等體積的上述菌液混合,按每只兔總量1 ml,背部皮下多點注射。

1.2.4 血清LOS-IgG及多種神經(jīng)節(jié)苷脂IgG抗體檢測 各組動物分別于初次免疫后2周、4周經(jīng)耳緣靜脈取血2 ml,分離血清,-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?采用 ELISA方法檢測血清中特異性抗 LOS-、GM1-、GD1a-、GD1b-、GD3-、GT1b-IgG 抗體。純化的LOS用新鮮配制的包被液稀釋成50 μ g/ml,包被酶標(biāo)板,100 μ l/孔 ;神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GD1a、GD1b、GD3及GT1b 稀釋成 2 μ g/ml,每孔 100 μ l包被,4℃過夜 ,10 g/L血清白蛋白(BSA)封閉,37℃濕盒孵育2小時;1∶50稀釋血清樣本每孔100 μ l,設(shè)復(fù)孔,37℃孵育2小時,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次;加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體,37℃孵育1小時;PBST洗3次;四甲基聯(lián)苯胺(TMB)避光顯色15分鐘,硫酸終止反應(yīng);設(shè)包被液作空白對照,封閉液作陰性對照,490 nm波長下讀取光密度值(OD 490)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計處理,數(shù)據(jù)以±s表示,均數(shù)間比較用t檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫前及免疫后不同時間血清LOS-IgG及多種神經(jīng)節(jié)苷脂IgG抗體水平見表1。①無論使用親代株還是waaF變異株全菌抗原,經(jīng)全身免疫后兩組動物血清均顯示抗LOS-IgG抗體滴度增高。免疫后14天,親代株及waaF變異株動物L(fēng)OS-IgG抗體水平為(0.758±0.136及0.744±0.125),較免疫前(0.250±0.101及0.226±0.083)相比明顯增高(P＜0.05),4周進一步增高為(0.971±0.214及0.975±0.172),為免疫前的4倍以上,親代株及waaF變異株兩組間抗體水平無明顯差異(P＞0.05),而對照組免疫前后LOS-IgG抗體水平無明顯改變。②接受親代株免疫的兔子,2周時血清抗GM1-IgG、GD1a-IgG及GT1b-IgG抗體水平分別為(0.661±0.290、0.487±0.041及0.457±0.071)與免疫前(0.173±0.081、0.151±0.038及0.182±0.101)相比明顯增高(P＜0.05),4周時進一步增高為(0.984±0.025、0.541±0.178及0.574±0.156)。而接受waaF變異株免疫的動物及對照組免疫后始終未見任何神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的增高。

表1 免疫后不同時點血清IgG抗體水平的變化(OD490,±s)Tab.1 Serum IgG titers at different time points after immunization(OD490,±s)

表1 免疫后不同時點血清IgG抗體水平的變化(OD490,±s)Tab.1 Serum IgG titers at different time points after immunization(OD490,±s)

Note:1)P＜0.05,compared with that before immunization.

Groups IgG antibody titers GM1 GD1a GD1b GD3 GT1b LOS Parental strain(n=10)0 day 0.173±0.081 0.151±0.038 0.170±0.109 0.176±0.045 0.182±0.101 0.250±0.101 14 day 0.661±0.2901) 0.487±0.0411) 0.180±0.126 0.157±0.051 0.457±0.0711) 0.758±0.1361)28 day 0.984±0.0251) 0.541±0.1781) 0.157±0.108 0.173±0.089 0.574±0.1561) 0.971±0.2141)waaF mutant(n=10)0 day 0.170±0.085 0.157±0.112 0.187±0.088 0.163±0.101 0.196±0.098 0.226±0.083 14 day 0.193±0.078 0.174±0.077 0.167±0.111 0.163±0.098 0.189±0.124 0.744±0.1251)28 day 0.180±0.063 0.147±0.108 0.163±0.056 0.157±0.076 0.177±0.098 0.975±0.1721)Control(n=6)0 day 0.163±0.056 0.159±0.167 0.189±0.176 0.144±0.065 0.153±0.043 0.203±0.065 14 day 0.178±0.060 0.217±0.181 0.168±0.076 0.193±0.234 0.212±0.167 0.275±0.078 28 day 0.171±0.082 0.189±0.045 0.134±0.023 0.134±0.034 0.215±0.078 0.243±0.087

3 討論

CJ是引起急性胃腸炎最常見的細(xì)菌之一,更重要的是該菌與常見的免疫性周圍神經(jīng)病GBS密切相關(guān)。大量流行病學(xué)及臨床血清學(xué)資料顯示,GBS常有CJ前驅(qū)感染史,GBS患者血清中含CJ的LOS抗體和多種抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體 ,抗GM1、GD1a、GD1b、GD3 及GT1b抗體與GBS的關(guān)系引起廣泛重視[3-5]。

CJ誘導(dǎo)GBS的確切機制尚不明確。目前,多數(shù)學(xué)者接受的分子模擬理論認(rèn)為,可能由于 CJ外膜上的LOS存在神經(jīng)節(jié)苷脂樣結(jié)構(gòu),通過交叉免疫導(dǎo)致周圍神經(jīng)損傷[1]。LOS類似脂多糖結(jié)構(gòu),LOS又分內(nèi)核及外核,外核上存在多種神經(jīng)節(jié)苷脂樣表位(ganglioside-like epitopes)。理論上說,若敲除LOS外核糖基合成的基因,則LOS不再含有任何神經(jīng)節(jié)苷脂模擬結(jié)構(gòu),不再能誘導(dǎo)動物周圍神經(jīng)免疫損傷,如此,便可在基因水平驗證分子模擬理論,同時也可解決因神經(jīng)節(jié)苷脂模擬結(jié)構(gòu)的存在,制約CJ菌苗安全性的問題。

本實驗對照親代株及waaF變異株免疫的結(jié)果顯示,CJ親代株確實含有多種神經(jīng)節(jié)苷脂樣結(jié)構(gòu),可刺激動物產(chǎn)生相應(yīng)多種神經(jīng)節(jié)苷脂抗體,而waaF變異株免疫的動物未見任何神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的增高,此結(jié)果從基因水平支持CJ誘導(dǎo)GBS發(fā)病的分子模擬理論學(xué)說。另一方面,waaF變異株雖丟失神經(jīng)節(jié)苷脂表位,但其LOS結(jié)構(gòu)仍具有免疫原性,仍可誘導(dǎo)LOS抗體產(chǎn)生,可能成為無神經(jīng)免疫毒性的CJ菌苗候選株。

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