王珊珊 徐國(guó)興

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜疾病的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展

王珊珊1.2徐國(guó)興1

1.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院

各種視網(wǎng)膜疾病，如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關(guān)性黃斑病變(AMD)等，視網(wǎng)膜光感受器的損傷可導(dǎo)致不可逆的視力喪失。對(duì)于此類(lèi)疾病，人們嘗試了很多方法來(lái)修復(fù)視網(wǎng)膜細(xì)胞變性，阻止視網(wǎng)膜光感受器的喪失，其中包括營(yíng)養(yǎng)支持治療、基因治療、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、以及人工眼等。然而，這些方法都未能取得確切的臨床療效，因此人們開(kāi)始轉(zhuǎn)向?qū)ふ液线m的細(xì)胞源作為移植物，通過(guò)視網(wǎng)膜的細(xì)胞移植來(lái)代替丟失的細(xì)胞或者起到支持細(xì)胞的作用，以阻止更進(jìn)一步的細(xì)胞丟失。

隨著干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)不斷突破，為我們最終有效的治療這些眼病，恢復(fù)患者的視功能提供了一個(gè)良好的契機(jī)。再加上眼睛的解剖結(jié)構(gòu)明確，并具有透明的屈光介質(zhì)、便于操作定位及觀察的特點(diǎn)，使得與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病相比，視網(wǎng)膜疾病在細(xì)胞移植方面發(fā)展得更為迅速。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞具有優(yōu)勢(shì)

干細(xì)胞是生物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育中具有自我更新、增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。目前研究較多用于視網(wǎng)膜移植的干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(ESC)和成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)和視網(wǎng)膜干細(xì)胞/祖細(xì)胞(RPC)等。但由于MSCs易于獲得，且無(wú)胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞的倫理障礙，同時(shí)也避免了異體移植的免疫排斥反應(yīng)，在目前臨床前試驗(yàn)和臨床應(yīng)用中尚未見(jiàn)致畸作用的發(fā)生。因此，MSCs在干細(xì)胞移植方面具有優(yōu)勢(shì)，也是目前研究相對(duì)深入的一群具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。

然而，要想實(shí)現(xiàn)MSCs的臨床應(yīng)用，就必須克服MSCs的選擇、培養(yǎng)擴(kuò)增、體外標(biāo)記、植入體內(nèi)及植入后的融合等一系列技術(shù)難題。目前，MSCs移植主要以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)象，已進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的階段，雖取得了一些突破，但同時(shí)也存在不少難題?，F(xiàn)從大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)研究近況和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞的研究近況二方面進(jìn)行綜述。

2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)研究近況

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于人體各種器官和組織，但最易得到、最富集和研究最多的是來(lái)源于骨髓。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在20世紀(jì)80年代初人們通過(guò)骨髓培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，它是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等。由于其多分化潛能和強(qiáng)大的自我更新能力，使BMSC可以作為種子細(xì)胞用于組織工程和基因治療的研究。

3 獲取含BMSCs的骨髓

據(jù)研究，BMSCs在骨髓中的濃度不高，約占有核細(xì)胞的0.001%～0.01%，要想成功獲取高質(zhì)量的BMSC需要在選擇大鼠并用適當(dāng)?shù)姆绞饺カ@取BMSCs的骨髓液。

3.1 不同周齡大鼠骨髓MSCs的分離效果不同

大部分文獻(xiàn)報(bào)道是以周齡作為選擇大鼠的指標(biāo)。Zhang等認(rèn)為骨髓MSCs的增殖能力與動(dòng)物年齡有關(guān)，隨著年齡增加，成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F )測(cè)定顯示骨髓克隆形成細(xì)胞的數(shù)量逐漸遞減。謝茂松等研究發(fā)現(xiàn)，在相同接種密度條件下，觀察到1 mo齡鼠的增殖能力較2mo和4 mo齡鼠強(qiáng)，2mo齡鼠的增殖能力較4mo齡鼠強(qiáng)。晏丹等對(duì)1mo到2mo齡鼠作了進(jìn)一步的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4周齡大鼠下肢骨分離所得的細(xì)胞數(shù)較少，原代培養(yǎng)長(zhǎng)出的細(xì)胞克隆少，很難匯合成片；8周齡大鼠骨髓中含有較多的脂肪細(xì)胞，密度梯度離心后，在白膜層形成顆粒狀聚集物，影響后續(xù)的分離與培養(yǎng)效果；6周齡的大鼠在細(xì)胞分離的質(zhì)和量上達(dá)最佳效果。故晏丹等主張選擇6周齡的大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

3.2 不同體重大鼠骨髓MSCs的分離效果不同

也有文獻(xiàn)報(bào)道是以體重作為選擇大鼠的指標(biāo)。Zhang等[1]認(rèn)為動(dòng)物體重對(duì)骨髓MSCs的分離有影響：體重≥250g的大鼠骨髓中含有較多的脂肪細(xì)胞，密度梯度離心后，在白膜層形成顆粒狀聚集物，影響分離效果；體重<150g的大鼠骨骼細(xì)小，分離所得的細(xì)胞數(shù)少。Zhang等認(rèn)為，150~250g左右的大鼠在骨髓MSCs分離的質(zhì)和量上可達(dá)到較佳效果。

3.3 獲得含BMSC骨髓液的方法

3.3.1沖洗法

骨髓沖洗法的剪斷股骨、脛骨的方法有二種，即干骺端和骨干中間剪斷法二種。謝茂松等[2]研究發(fā)現(xiàn)，剪去干骺端法和骨干間剪斷法在細(xì)胞純度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但獲取的MMSC細(xì)胞上，剪去干骺端法比骨干間剪斷法數(shù)量少，這可能與BMSCs主要在干骺端有關(guān)。

3.3.2夾碎震蕩法

余勁明等用將大鼠的股骨、脛骨完全剝離，清除肌肉組織后，直接用止血鉗將骨完全夾碎，尤其是干骺端，后充分暴露骨髓腔，通過(guò)震蕩盡可能使造血干細(xì)胞置于緩沖液中。再用篩網(wǎng)過(guò)濾去除碎骨，離心后獲取細(xì)胞。改良操作后，與傳統(tǒng)的沖洗法相比，操作時(shí)間縮短，獲取的P0細(xì)胞活性沖洗好，更有利于細(xì)胞的擴(kuò)增和純化。余勁明等[3]認(rèn)為原因是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨頭較細(xì)，傳統(tǒng)的沖洗法使用注射器沖出骨髓細(xì)胞的操作時(shí)間長(zhǎng)，使獲得的BMSCs細(xì)胞活性下降。

4 分離純化BMSCs

4.1 分離法的種類(lèi)

BMSCs最初的分離培養(yǎng)方法由Friedenstein于1976年建立，主要通過(guò)貼壁培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞分離。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)MSCs的提取和擴(kuò)增方法有如下幾種：?jiǎn)渭冑N壁篩選法、免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞儀分離法及密度梯度離心法。

4.1.1流式細(xì)胞儀分離法。流式細(xì)胞儀分離法是根據(jù)不同細(xì)胞具有不同的表面標(biāo)志，以熒光抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，該方法的優(yōu)點(diǎn)是分離迅速、純度高，但儀器昂貴，費(fèi)用較高，對(duì)含量太低的細(xì)胞難以分離，而且不能處理大量的樣品。

4.1.2免疫磁珠分選法。免疫磁珠分選法是根據(jù)磁珠具有既能結(jié)合蛋白質(zhì)又可被磁鐵所吸附的特性進(jìn)行分選的。經(jīng)過(guò)一定處理將抗體或抗原結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體或抗原的載體，磁珠上抗體或抗原與特異性抗原或抗體結(jié)合后，形成抗原抗體磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，從而達(dá)到分離特異性抗原或抗體的目的。該方法的優(yōu)點(diǎn)是避免了免疫毒素和補(bǔ)體裂解帶來(lái)的非特異性殺傷作用，且可以處理大量的細(xì)胞樣品，因此在臨床和基礎(chǔ)研究中具有很誘人的應(yīng)用前景，但價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜。

4.1.3單純貼壁篩選法。貼壁篩選法是利用細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁牢固性的不同，逐步將非貼壁細(xì)胞和其它雜質(zhì)細(xì)胞去除的一種簡(jiǎn)單易行的方法，實(shí)驗(yàn)表明貼壁法分離大鼠BMSCs傳10多代仍能保持旺盛的生長(zhǎng)和增殖能力。

4.1.4密度梯度離心法。密度梯度離心法是利用MSCs與其他細(xì)胞密度的不同，用特定密度的淋巴細(xì)胞分離液將MSCs分離出來(lái)。常用分離液有密度可調(diào)的Percoll分離液和密度固定的聚蔗糖-泛影葡胺分層液Ficoll-Hypaque (商品名Fi-coll )分離液二種。有研究表明，在MSCs的分離中，Percoll較Fi-coll能得到更純的細(xì)胞群體，并認(rèn)為Percol與Fi-coll相比，Percoll具有無(wú)毒、無(wú)刺激性，能較好地保持細(xì)胞活性，并且可用于分離不同密度的細(xì)胞或顆粒等優(yōu)點(diǎn)。余勁明等[3]認(rèn)為不同密度Percoll的分離效果不同，他們采用70%的Percoll液(密度1.087g/mL，大鼠單個(gè)核細(xì)胞密度m)和57%的Percoll液(密度為1.073g/mL)進(jìn)行密度梯度離心，結(jié)果顯示，70%Percoll分離效果欠佳，紅細(xì)胞沉降不良；而57%Percoll分離效果較好，白膜層未見(jiàn)紅細(xì)胞摻雜。

4.2 各種分離法的比較

因?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞目前還沒(méi)有公認(rèn)的獨(dú)特抗原表型，再加上免疫磁珠分離法和流式細(xì)胞儀分離法分離出的細(xì)胞數(shù)量少，活性低，加之技術(shù)難、成本高，所以較少采用。目前大部分實(shí)驗(yàn)室分離使用的仍是單純貼壁篩選法或密度梯度離心法，免疫磁珠分離法和流式細(xì)胞儀分離法則用在鑒定上。

密度梯度離心法和單純貼壁篩選法兩種方法均可分離培養(yǎng)出較純化的BMSCs。楊麗等[4]研究發(fā)現(xiàn)：與密度梯度離心法相比，全骨髓貼壁法操作步驟簡(jiǎn)單，既降低了離心對(duì)細(xì)胞的損害，又減少了污染機(jī)會(huì)，節(jié)省經(jīng)費(fèi)，且分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁時(shí)間短，增殖快，細(xì)胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致。李爽等則認(rèn)為：密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)和消化控制相結(jié)合，是一種比較理想的分離純化方法。趙瑛等[5]采用Percoll(1. 073 g/mL)密度梯度分離和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合的方法能夠成功分離純化。

4.3 分離法的改良

由于單純貼壁篩選法的純度不如密度梯度離心法，有學(xué)者對(duì)分離方法進(jìn)行改良。

劉東寧等采用0.85% NH4Cl溶液分離培養(yǎng)Long-Evans大鼠股的BMSCs，其原理為0.85% NH4Cl溶液可降低環(huán)境滲透壓，選擇性快速裂解紅細(xì)胞，所余細(xì)胞成分即主要為白細(xì)胞和有核骨髓細(xì)胞，通過(guò)定期更換培養(yǎng)液，剔除不貼壁生長(zhǎng)的白細(xì)胞和造血干細(xì)胞，所余貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞即主要為BMSCs。細(xì)胞傳P3代后純度高達(dá)94%以上，與密度梯度離心法相近。

謝茂松等[2]在換液時(shí)運(yùn)用化學(xué)螯合劑EDTA吸收Ca2+、Mg2+，使未貼壁能力弱或粘附而未貼壁的造血系細(xì)胞等細(xì)胞分離，而對(duì)于貼壁能力較強(qiáng)的BMSCs細(xì)胞影響極少，從而提高M(jìn)MSC細(xì)胞的純度，使提純的純度與密度梯度離心法比較無(wú)顯著差異。

5 鑒定BMSCs

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞目前還沒(méi)有公認(rèn)的獨(dú)特抗原表型。所以大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室都采取從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期以及表面標(biāo)志物表達(dá)三方面來(lái)鑒定BMSCs。

5.1 細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞形態(tài)用的標(biāo)準(zhǔn)一致，都為長(zhǎng)梭形細(xì)胞。

5.2細(xì)胞周期測(cè)定：都是以BMSCs絕大多數(shù)處于靜止期，只有極少量細(xì)胞處于增殖期為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

5.3表面標(biāo)志物：由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原不是獨(dú)特的，所以目前鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的方法只能用說(shuō)明培養(yǎng)細(xì)胞既非造血干細(xì)胞，也非成纖維細(xì)胞，以推測(cè)分離培養(yǎng)最大可能是間充質(zhì)干細(xì)胞。國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)提出了鑒定人來(lái)源MSC的3條最低標(biāo)準(zhǔn)：①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSC必須具備對(duì)塑料底物的貼附性；②通過(guò)FCM檢測(cè)，MSC群體表達(dá)CD105、CD73及CD 90陽(yáng)性率≥95%，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19，HLA-DR陽(yáng)性率≤2%；③經(jīng)體外誘導(dǎo)，MSC必須能向少成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等分化。該標(biāo)準(zhǔn)特別指出，對(duì)于動(dòng)物來(lái)源的MSC，除第2條標(biāo)準(zhǔn)不具有普遍意義的適用性外，第1條、第3條描述的生物學(xué)特征同樣適用于動(dòng)物來(lái)源的MSC。

大部分的實(shí)驗(yàn)室用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性的指標(biāo)CD29、 CD44以及表達(dá)陰性的指標(biāo)CD34作為鑒定參考指標(biāo)。也有實(shí)驗(yàn)室用CD14、CD44表達(dá)陰性，CD90、CD45表達(dá)陽(yáng)性，來(lái)說(shuō)明已形成了純化的BMSCs細(xì)胞群。李爽等選取CD29，CD45，CD105和CD166作為其鑒定標(biāo)記。

6 體外擴(kuò)增

6.1 培養(yǎng)基選擇

P0MSCs生長(zhǎng)狀況與使用不同血清濃度密切相關(guān)，10%血清足夠細(xì)胞的生長(zhǎng)需要，血清濃度過(guò)高則會(huì)加速細(xì)胞的分化及衰老。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于P0細(xì)胞而言，含15%FBS培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)明顯快于5%、10%和20%FBS培養(yǎng)基，而無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)。而在P3以后的細(xì)胞，含5%FBS培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)好，細(xì)胞形態(tài)大部分為長(zhǎng)梭形，15%、20%FBS培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但出現(xiàn)細(xì)胞分化現(xiàn)象，形態(tài)改變。因此，建議在原代培養(yǎng)中使用15%FBS，而在BMSCs純化階段，使用5%FBS有利于獲取大量高純度的細(xì)胞。

6.2 接種密度

傳統(tǒng)的接種密度為8×103/cm2。但晏丹等[6]通過(guò)比較BMSCs傳代時(shí)的不同接種密度，認(rèn)為5×103/cm2接種密度最佳，5×103/cm2接種密度有利于維持BMSCs的多向分化潛能。

6.3 選擇代次

選擇生長(zhǎng)狀況良好，增殖能力活躍，形態(tài)均一，純度高，尚未出現(xiàn)退化現(xiàn)象，具有良好生物學(xué)特性的一代。研究發(fā)現(xiàn)，P0細(xì)胞增殖較慢，但是在傳代純化細(xì)胞后，由于BMSCs所占的比例增加，細(xì)胞增殖逐漸加快，P3~P9細(xì)胞按1∶3傳代后，均可在一周內(nèi)再次傳代。P10大鼠BMSCs出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，老化現(xiàn)象。李爽等[7]研究發(fā)現(xiàn)，P1-P5代最快，以后生長(zhǎng)速度減慢。這與以往的有些文獻(xiàn)報(bào)道不同。楊晉等研究結(jié)果表明，培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從第2代開(kāi)始到第5代細(xì)胞生長(zhǎng)周期穩(wěn)定，從第5代以后，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢，傳代周期延長(zhǎng)，約需要10d左右。目前國(guó)內(nèi)外大部分實(shí)驗(yàn)中使用的均為P3~P10。

穩(wěn)定、有效的MSCs分離、體外培養(yǎng)與擴(kuò)增的方法為今后骨髓BMSCs的較為深入的研究奠定了基礎(chǔ)。

7 MSC在眼科的應(yīng)用挑戰(zhàn)

MSC作為一種成體干細(xì)胞，除具有干細(xì)胞的共性外，還具有如下優(yōu)勢(shì)：取材方便且對(duì)機(jī)體無(wú)害；由間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)來(lái)的組織在進(jìn)行移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥問(wèn)題；間充質(zhì)干細(xì)胞在理論上可以向任何組織分化。盡管近年來(lái)對(duì)MSC的研究取得了很大進(jìn)展，但仍然存在以下問(wèn)題尚待解決：(1)成體干細(xì)胞含量極微，每10萬(wàn)個(gè)骨髓有核細(xì)胞中約含有1個(gè)MSC，并且隨著年齡的增加或體質(zhì)的衰弱，細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少；(2)目前尚未能建立鑒定MSC的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，至今還未能篩選到MSC特異性的標(biāo)記分子；(3)MSC具有多系分化潛能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在體外的分化是否會(huì)引起MSC遺傳特性的改變還有待進(jìn)一步證實(shí)；(4)是何種信號(hào)誘導(dǎo)了骨髓MSC向多系分化，其誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制尚不明了。綜上所述，雖然理論上干細(xì)胞研究為眼科學(xué)者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑戰(zhàn)性的屏障問(wèn)題獲得解決，人類(lèi)疾病的治療才能邁入“干細(xì)胞”時(shí)代。

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福建省重點(diǎn)科研課題（基金編號(hào)：2008Y0040）。

徐國(guó)興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。