蘭 蓉，張 震，吳 迪，陳亞菲，馬 辰

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100029）

白靈菇又名阿魏蘑、阿魏菇，是一種野生名貴食（藥）用菌。白靈菇營養(yǎng)豐富，據(jù)科學(xué)測定，白靈菇含蛋白質(zhì)14.7%、碳水化合物43.2%、脂肪4.3%、粗纖維15.4%、灰分4.8%、多糖19%[1]。由于白靈菇生長在藥用植物阿魏上，因此白靈菇具有防癌、抗癌、防治老年人心血管病、婦科腫痛、兒童佝僂病等藥用功效[2]。白靈菇中的真菌多糖還有增強(qiáng)人體免疫力、調(diào)節(jié)人體生理平衡的作用[3]。目前白靈菇的生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)的固體栽培方式，栽培周期長、生物轉(zhuǎn)化率低，難以滿足市場需求。采用液體培養(yǎng)方式發(fā)酵生產(chǎn)白靈菇，在短時間內(nèi)能產(chǎn)生大量的菌絲體和代謝產(chǎn)物，但白靈菇液體發(fā)酵方面的研究報道不多[4]。通過對白靈菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選及優(yōu)化，旨在為白靈菇的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

白靈菇菌種：由北京薛瑞菌業(yè)公司提供；斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2.0%、瓊脂2.0%；液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2.0%；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2.5%、(NH4)2SO40.5%，起始pH為6.5。

試劑：葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、蔗糖、NH4NO3、(NH4)2SO4、 NaNO3、 NH4Cl、酵母粉、蛋白胨、HCl、NaOH、蒸餾水、乙醇。

1.2 設(shè)備

超凈工作臺，北京市昌平長城空氣凈化工程公司，HZQ-Q；生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠，LRH-250-A；高壓滅菌鍋，北京市永光明醫(yī)療器械廠，GMSX-280；恒溫?fù)u床，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司，HZ200L；離心機(jī)，北京市金儀儀器制造有限公司，TDL-5；恒溫干燥箱，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，HPG-9145。

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)方法

2.1.1 斜面培養(yǎng)

將大小約0.5 cm2的已活化斜面菌種接種到斜面培養(yǎng)基中，27℃培養(yǎng)，直至長滿斜面培養(yǎng)基表面。

2.1.2 液體種子制備

250 mL三角燒瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基100 mL，接種2塊～3塊約0.5 cm2大小的斜面菌種，置于恒溫?fù)u床，140 r·min-1、25℃培養(yǎng)6 d，無菌條件下用無菌長柄剪刀將搖瓶中菌球剪碎，得液體種子。

2.1.3 搖瓶培養(yǎng)

將液體種子按10%（體積比）接種量，接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，并于25℃、140 r·min-1培 養(yǎng) 7 d[20]。

2.2 測定方法

胞外多糖含量的測定：發(fā)酵液3500 r·min-1離心15 min，留上清液備用。在上清液中加入95%乙醇至乙醇終濃度為70%，4℃下醇析過夜，離心后將得到的沉淀50℃真空干燥至恒重，稱重，即為多糖含量。

2.3 培養(yǎng)基的單因素試驗

通過上述搖瓶培養(yǎng)的方式，利用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行單一碳源和氮源篩選實驗。

2.3.1 碳源篩選實驗

分別用乳糖、蔗糖、果糖和木糖取代發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，在其中篩選出最適碳源。

2.3.2 氮源篩選實驗

分別用NH4NO3、NaNO3、NH4Cl、酵母粉和蛋白胨取代發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的 (NH4)2SO4，在其中篩選出最適的氮源。

2.4 培養(yǎng)條件的單因素試驗

2.4.1 接種量篩選試驗

在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別接種2.5%、5%、10%、15%和20%的液體種子，25℃、140 r·min-1搖床培養(yǎng) 7 d，篩選出最適接種量。

2.4.2 裝液量篩選試驗

在250 mL的錐形瓶中，分別裝入 60 mL、90 mL、120 mL、150 mL、180 mL的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，均接種10%的液體種子，25℃、140 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，篩選出最適裝液量。

2.4.3 培養(yǎng)時間篩選試驗

100 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種10%的液體種子，25℃、 140 r·min-1搖床培養(yǎng) 7 d，分別培養(yǎng) 5 d、 6 d、 7 d、8 d、9 d，篩選出最適培養(yǎng)時間。

2.4.4 pH篩選試驗

分別將發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的起始pH調(diào)為4.5、5.0、5.5、6.0、 6.5、 7.0、 8.0，接種 10%，25℃、 140 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，篩選出最適pH。

2.5 正交試驗

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，以白靈菇胞外多糖為指標(biāo)，安排正交試驗，以進(jìn)一步優(yōu)化白靈菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，具體的因素和水平見表1和表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 培養(yǎng)基的單因素實驗結(jié)果

3.1.1 碳源篩選實驗

表1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗因素水平表

表2 液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗因素水平表

碳源對胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見表3。

表3 碳源單因素實驗結(jié)果

從表3可看出，5種碳源中葡萄糖的效果最好，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高值，果糖次之，木糖最差。

3.1.2 氮源篩選試驗

氮源對胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見表4。

表4 氮源單因素實驗結(jié)果

從表4可看出，6種氮源中蛋白胨的效果最好，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高值，酵母粉次之。

3.2 培養(yǎng)條件的單因素實驗結(jié)果

3.2.1 接種量篩選試驗

5種接種量對胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見表5。

表5 接種量單因素實驗結(jié)果

從表5可看出，隨著接種量的增加，多糖產(chǎn)量也隨之增加，說明在2.5%～20%范圍內(nèi)，接種量越多越好。

3.2.2 裝液量篩選試驗

裝液量對胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果具體見表6。

表6 裝液量單因素實驗結(jié)果

從表6可看出，裝液量為120 mL時，胞外多糖產(chǎn)量最高。

3.2.3 培養(yǎng)時間篩選試驗

培養(yǎng)時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響具體見表7。

表7 培養(yǎng)時間單因素實驗結(jié)果

從表7可看出，胞外多糖含量在第7天時達(dá)到最大值，超過第7天多糖含量開始下降。

3.2.4 pH篩選試驗

pH值對胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見表8。

表8 pH單因素試驗結(jié)果

從表8可看出，pH值為6.5時效果最好，多糖產(chǎn)量達(dá)到最高值，pH7.0次之，4.0最差。

3.3 培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果

白靈菇發(fā)酵最適培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果與極差分析結(jié)果見表 9。

表9 白靈菇搖瓶發(fā)酵最適培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果與極差分析

由表9極差值R可看出，各因素對白靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響先后順序是A＞C＞B，即碳源對胞外多糖產(chǎn)量的影響最大，無機(jī)鹽其次，氮源的影響相對最弱。從優(yōu)水平來看，白靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)基組合為A3B3C1，而胞外多糖產(chǎn)量最多的培養(yǎng)基組合為A2B3C1，經(jīng)3次重復(fù)實驗驗證，得白靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)基組合為A2B3C1，即葡萄糖2%、蛋白胨0.75%、CaCl20.2%。

3.4 培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果

白靈菇發(fā)酵最適培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果與極差分析結(jié)果見表10。

表10 白靈菇發(fā)酵最適培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果與極差分析

由表10極差值R可看出，各因素對白靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響先后順序是A=D>B>C，即起始pH值和培養(yǎng)天數(shù)對胞外多糖產(chǎn)量影響最大，接種量其次，裝液量的影響相對最弱。從優(yōu)水平來看，白靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)條件組合為A3B2C2D2，而胞外多糖產(chǎn)量最多的培養(yǎng)條件組合為A3B3C2D1，經(jīng)3次重復(fù)實驗驗證，得白靈菇發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)條件組合為A3B3C2D1，即起始pH值7.0，接種量20%，裝液量120 mL，培養(yǎng)天數(shù)6 d。

4 結(jié)論

根據(jù)上述實驗結(jié)果，得出白靈菇液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)基組合：葡萄糖2%、蛋白胨0.75%、CaCl20.2%；白靈菇液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)條件為：起始pH值7.0，接種量20%，裝液量120 mL，培養(yǎng)天數(shù)6 d。

[1]申進(jìn)文，閆永先.白阿魏蘑菌種培養(yǎng)基篩選試驗[J].食用菌，2000(20)：28.

[2]林杰.白靈菇栽培技術(shù)要點[J].中國食用菌，2000，19(5)：28-29.

[3]陳忠純.阿魏側(cè)耳的栽培技術(shù)[J].干旱區(qū)研究，1994，11(2)：65-68.

[4]趙永勛.食藥用菌液體發(fā)酵的現(xiàn)狀和展望[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)， 2004，24(3)：111-114.