【作者】種敏琪，秦斌杰

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，上海，200240

光譜分離(Spectal Unmixing)技術(shù)在衛(wèi)星遙感成像、生物熒光成像領(lǐng)域是一個重要的技術(shù)。國內(nèi)外在衛(wèi)星遙感成像光譜分離的研究已經(jīng)有幾十年的歷史，但還沒有很成熟的算法解決，這個領(lǐng)域公認(rèn)的難點(diǎn)譬如如何有效地提取端元[1-3]。在遙感成像的高光譜場景中，各個像元的信息大都是由不同組分混合而成的，所謂端元提取就是提取出不同組分純指紋光譜的一個處理過程。基于這些不同組分物質(zhì)的純指紋光譜，通過譜分離算法再把遙感場景分解成不同豐度(abundance fraction)的多種物質(zhì)。

近年來，隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物熒光成像譜分離領(lǐng)域[4]也有極大的發(fā)展。生物熒光成像大都利用檢測目標(biāo)熒光蛋白的方法，觀察活體小動物體內(nèi)單細(xì)胞水平的生物學(xué)演變過程。由于動物組織以及胃內(nèi)食物中存在彈性蛋白和膠原蛋白等類物質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的激發(fā)波長與發(fā)射波長與GFP等目標(biāo)熒光蛋白類似。因此，在這些譜段進(jìn)行熒光成像，熒光圖像均存在微弱的自發(fā)熒光。另外，如果動物體內(nèi)有多標(biāo)記目標(biāo)熒光組分時，則在一定的激發(fā)光照射下，在高靈敏CCD采集的多通道圖像像元上會有多個熒光組分的混合，基于這些現(xiàn)象，譜分離技術(shù)就成了熒光成像的必然要求。

衛(wèi)星遙感成像時，往往在很多個成像通道進(jìn)行連續(xù)譜段高光譜圖像采集，這可以確保有足夠的冗余信息準(zhǔn)確分辨出每一種組分在高光譜圖像中的豐度。而在生物熒光成像時，往往感興趣的在體目標(biāo)熒光組分?jǐn)?shù)目一般在1～2個左右，再加上引起小動物自發(fā)熒光的組分?jǐn)?shù)目也可以設(shè)定為1～2個左右，因此，原則上用于生物熒光成像譜分離的多光譜圖像，只需在3～5個譜段采集就行。因此，本研究一個重要的目的就是驗證，在遙感成像研究領(lǐng)域常用的端元提取和線性譜分離算法是否適用于生物熒光成像的譜分離。

1 原理及方法

熒光成像譜分離的主要原理是：注射了熒光基團(tuán)的小動物在多個波長激發(fā)光(如圖1用波長為488和波長為594的激發(fā)光分別激發(fā)照射熒光染料Alexa Fluor 488 Dye 和Alexa Fluor 594 Dye[5])的激發(fā)照射下，對應(yīng)不同譜段的發(fā)射光圖像會在多個成像通道被采集?；诿總€成像像元是不同組分熒光基團(tuán)的線性疊加假設(shè)，線性譜分離技術(shù)從混合的像元中分離出不同光譜特性熒光組分的貢獻(xiàn)比例（所謂豐度contribution fractions），進(jìn)而根據(jù)這些熒光組分的豐度推測目標(biāo)熒光蛋白在小動物體內(nèi)目標(biāo)區(qū)域的表達(dá)程度。

線性譜分離算法的主要步驟[6]是：首先通過如主分量變化、最小噪聲分離[7](MNF, minimum noise fraction，MNF變換等同于噪聲調(diào)節(jié)主分量變換，Noise Adjusted Principle Component transform[8])等變換技術(shù)，對多/高光譜圖像進(jìn)行有效降維，使計算量降低；對構(gòu)成混合像元各特定組分的參考光譜進(jìn)行估計，這里也稱為端元估計(endmember determination)，包括端元數(shù)量的估計以及各端元參考光譜的估計；接著就是求逆的過程，即依據(jù)多譜段輸出圖像和各端元參考光譜，估計出各特定組分的豐度。具體來說，線性譜分離滿足線性疊加原理：

這里b為像素的亮度，a為端元本身的強(qiáng)度，s為端元豐度，w為噪聲，m為端元總數(shù)量，滿足上式對于圖像中的每一個像素均適用，將一個通道采集圖像的每個像素信息添加為矩陣的一列。對于多個通道的采集圖像來說，上面的公式可以標(biāo)識為矩陣形式如下：

其中B為采集的多通道圖像的像素亮度矩陣，S為待求取的端元豐度矩陣，A為端元參考光譜矩陣（即各組分在各個熒光波段下采集到的信號強(qiáng)度，該數(shù)據(jù)雖可以參考出廠標(biāo)注的熒光染料發(fā)射光譜，如圖1a，b實(shí)線顯示的即為Alexa Fluor 488 Dye 和Alexa Fluor 594 Dye的發(fā)射光譜，但一般需要從采集圖像中估計出來才更有現(xiàn)實(shí)意義），W為噪聲矩陣。通過對多通道圖像進(jìn)行線性方程組的求解，即可獲得每個熒光基團(tuán)端元在不同像素中的豐度，從而分離出不同熒光基團(tuán)在小動物體內(nèi)空間位置及表達(dá)強(qiáng)度等的更進(jìn)一步信息。

圖1 Alexa Fluor 488 Dye 和Alexa Fluor 594 的吸收光譜和發(fā)射光譜[5]Fig.1 The absorption and emission spectra for Alexa Fluor 488 Dye and 594 Dye[5]

在圖2中，我們形象地簡述一兩個波段下譜分離成像的背景。實(shí)心點(diǎn)代表著純像素的端元點(diǎn)，它們在波段i和波段j上是光亮度的最大值或者最小值。而空心圓點(diǎn)代表著普通的混合像素點(diǎn)，它們是經(jīng)由三個端元進(jìn)行線性疊加而得到的。由于公式1的約束條件，這些混合點(diǎn)一定落在三個端元所圍繞的凸包之內(nèi)。

圖2 兩個波段下譜分離成像的原理簡圖Fig.2 A schematic diagram of spectral unmixing for two-band multispectral imaging

首先，我們需要對圖像進(jìn)行降噪和降維的處理，MNF算法在降維的同時還可以對噪聲進(jìn)行初步的抑制，效果較好。譜分離成像的過程分為兩步：第一步是端元的確定，通過所有的點(diǎn)在不同波段下的亮度，求出端元點(diǎn)數(shù)，這也是本篇文章研究的重點(diǎn)；第二步通過公式(2)，在已知端元的情況下，我們可以利用最小二乘法[12,13]解出矩陣S。從而獲知每個混合像素點(diǎn)中各個端元的組成比例，達(dá)到譜分離成像的目的。

現(xiàn)在流行的端元分離算法主要有：convex cone analysis、iterative error analysis(IEA)、 pixel purity index(PPI)、N-FINDR以及orthogonal subspace projection等幾種[1-3]。由于我們需要在僅輸入每個像素點(diǎn)亮度的情況下分離出端元點(diǎn)，并且希望算法是能在非人為控制下自動完成的。因此，通過進(jìn)行分析比較，我們發(fā)現(xiàn)適合的經(jīng)典端元分離方法主要有2種，基于像素點(diǎn)特征的PPI[9,10]以及基于矩陣特性的N-FINDR[9]算法?，F(xiàn)在對這兩種算法的原理及流程進(jìn)行分別闡述。

1.1 PPI算法[9-10]

PPI算法的原理是在每一個頻譜段，總有一個端元會產(chǎn)生最強(qiáng)的亮度，而其它的像素點(diǎn)的亮度必定小于等于最強(qiáng)端元產(chǎn)生的亮度。基于這個原理，我們排除不可能成為端元的點(diǎn)，獲取可能的端元數(shù)目及其分布。

為了達(dá)到這個目的，我們采取向量內(nèi)積的方法，通過隨機(jī)生成大量的相互獨(dú)立的矢量，計算每個像素點(diǎn)在這些矢量上的內(nèi)積，篩選其中內(nèi)積最大或者最小的，作為可能的備選端元。然后不斷重復(fù)這個過程，直到所有的剩余像素點(diǎn)都可以在某一方向向量上有著最大或者最小的內(nèi)積為止，這些剩余像素點(diǎn)就是端元。如下圖3中，畫的點(diǎn)在參考矢量上擁有著最大或者最小的投影，因此在本輪篩選中將其作為可能的端元而保留。

圖3 PPI算法原理Fig.3 The basic principle of PPI algorithm

我們可以使用Auto-PPI(APPI)算法全自動地完成整個篩選過程，其算法簡單描述如下：

1）隨機(jī)生成多個線性無關(guān)向量；

2）對圖像中的每一個點(diǎn)，將其多光譜向量與隨機(jī)生成向量做內(nèi)積運(yùn)算；

3）統(tǒng)計內(nèi)積運(yùn)算結(jié)果，剔除在任一隨機(jī)向量上內(nèi)積均不為最大值的像素點(diǎn)；

4）如果剔除了新的點(diǎn)，則跳回1；

5）剩余像素點(diǎn)為所需端元。

PPI流程如圖4所示。

1.2 N-FINDR算法[11]

N-FINDR算法是一種在已知端元數(shù)量的前提下比較好的算法。它利用了各個波段下端元點(diǎn)之間的亮度差值大于混合點(diǎn)之間亮度差的原理，通過嘗試不同點(diǎn)相互之間的組合進(jìn)行比較，從而確定更加接近端元的點(diǎn)集。而在圖像中存在端元的條件下，這些結(jié)果點(diǎn)集就是端元點(diǎn)的集合。

根據(jù)以上的介紹，算法的實(shí)現(xiàn)步驟主要是通過隨機(jī)選取的像素作為現(xiàn)有可能像素，然后對備選像素的矩陣做行列式，如果在替換了新的像素后行列式的值增加，那么就用新的像素替換原有像素，直到所有的像素點(diǎn)均嘗試過為止。此算法描述如下：

圖4 PPI算法的流程圖Fig.4 The flow chart of PPI algorithm

1）隨機(jī)選取點(diǎn)作為初始行列式并計算其值；

2）從剩余的點(diǎn)中選取一個替代原有點(diǎn)并計算新的行列式的值；

3）若行列式值變大，則替換這個點(diǎn)，否則，舍棄這個點(diǎn)；

4）跳回1直到所有的點(diǎn)被嘗試過；

5）最終行列式取最大值的像素點(diǎn)為所需端元。N-FINDR流程如圖5所示。

圖5 N-FINDR算法流程圖Fig.5 The flow chart of N-FINDR algorithm

1.3 兩種算法的混合

PPI算法對于隨機(jī)向量有著一定的要求，否則將會產(chǎn)生一些并不真實(shí)的端元，尤其對于并不滿足嚴(yán)格線性疊加條件的實(shí)驗數(shù)據(jù)，某些混合點(diǎn)的亮度值過大，PPI算法會將它們視為端元并計入到計算結(jié)果中。N-FINDR算法則涉及了復(fù)雜的行列式計算，并且需要預(yù)先明確端元數(shù)量。而在生物熒光成像這種波段數(shù)較少的條件下，它們的缺點(diǎn)則更為明顯。為此，我們對兩種算法進(jìn)行了合并，可以得到一個更好的實(shí)驗結(jié)果。合并中，程序先根據(jù)適當(dāng)?shù)拈撝颠M(jìn)行多次PPI算法的循環(huán)，再對剩余點(diǎn)進(jìn)行N-FINDR算法，來獲得一個更加可靠的結(jié)果。

2 實(shí)驗結(jié)果及討論

2.1 C++隨機(jī)模擬數(shù)據(jù)

我們利用C++中algorithm庫的隨機(jī)函數(shù)生成了由四個虛擬端元組成的1000個像素點(diǎn)矩陣，生成了一個類似于圖2的四維矩陣(圖2為2維)。在這個矩陣中，包含了4個端元點(diǎn)以及他們在公式(1)約束下生成的大量混合像素點(diǎn)（類似圖2），通過對這些隨機(jī)數(shù)據(jù)求解，來驗證算法的有效性。

這4個虛擬端元為：(100,0,10,0)、(1,100,1,1)、(0,0,100,50)、(10,10,10,100)括號內(nèi)數(shù)字的含義表明端元點(diǎn)在不同波段的亮度值（公式2中的矩陣A），每個混合像素點(diǎn)的亮度正是由這些端元亮度值的線性疊加（通過隨機(jī)生成的豐度矩陣S）而形成的。通過公式

進(jìn)行歸一化，其中b'為歸一化后的值，為像素點(diǎn)本身值（既隨機(jī)生成像素點(diǎn)的亮度），max為最亮像素點(diǎn)值（最大值為100），min為最暗像素點(diǎn)值（最小值為0）。之后通過PPI，N-FINDR和混合算法3種方法分別計算出端元。計算的結(jié)果表明，對于此類完全符合線性疊加原理，并且每個端元之間有著明顯的差異的理想情況下，PPI和N-FINDR算法都有著良好的效果。能夠準(zhǔn)確地分離出4個端元。

2.2 實(shí)驗成像及處理

我們使用的成像系統(tǒng)是QuickView3000，熒光染料為Alexa Fluor 488 Dye 和Alexa Fluor 594 Dye，其參考光譜見圖1。我們分別把兩種染料以5種不同的混合比例（100%，0），（75%，25%），（50%，50%），（25%，75%），（0%，100%）置于在96孔板中。采集兩幅圖像的帶通波長范圍分別為470～530 nm和565～630 nm，成像結(jié)果見圖6所示。

圖6 兩通道多光譜圖像采集Fig.6 The two-band images in multispectral imaging

對于如上采集得到的兩幅多圖像，我們分別通過MATLAB從成像系統(tǒng)進(jìn)行導(dǎo)入和歸一化處理。再通過C++實(shí)現(xiàn)PPI和N-FINDR算法，分別對其進(jìn)行端元分離。結(jié)果見表1。

表1 PPI算法和N-FINDR算法的實(shí)現(xiàn)結(jié)果Tab.1 The results of PPI and N-FINDR algorithms

圖7 端元像素點(diǎn)的分布Fig.7 The distribution of endmember pixels

在圖7中可以看到，端元1端元3所在像素落在紅色圓圈的試管內(nèi)，它們是真實(shí)的端元。端元2端元4所在像素落在藍(lán)色的試管內(nèi)，它們是假的端元。

我們發(fā)現(xiàn)，因為PPI算法由于是自動確定端元，所以計算出來的端元數(shù)量是可能變化的。從表1中可以看到，端元2和端元4并非真正的端元，但是它們依舊出現(xiàn)在了PPI的計算結(jié)果中，其具體的出現(xiàn)與否取決于PPI算法隨機(jī)化初始條件。在某些情況下，這些端元并不會被算法本身篩選掉。我們雖然可以通過多次隨機(jī)化以及增加篩選次數(shù)（試驗中發(fā)現(xiàn)，將篩選輪數(shù)由3增加到30可以有效的減少端元2和端元4在結(jié)果中出現(xiàn)的頻率），但是這樣的代價妨礙了算法實(shí)現(xiàn)的效率。

而對于N-FINDR算法，雖然其準(zhǔn)確率較高，但是非常依賴于事前對于端元數(shù)的估算。我們可以看到，對于不同的假定端元數(shù)，直接決定了端元2是否存在于最后的計算結(jié)果之中。

我們可以看出兩種算法在端元分離中的各自優(yōu)缺點(diǎn)：N-FINDR有著計算速度快，能夠準(zhǔn)確地計算出最優(yōu)m個端元的優(yōu)點(diǎn)，但同時需要預(yù)先對m有一個準(zhǔn)確的確定；PPI算法則計算速度較慢，并且會挑出一些并不是端元的可能像素點(diǎn)，但是同時卻也有著不會因為m的誤差而篩除端元的可能。

因此，將兩種算法的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，先通過一個較少循環(huán)的PPI算法剔除大量的像素點(diǎn)，然后再通過N-FINDR算法對于剩余的像素點(diǎn)進(jìn)行計算處理（由于像素點(diǎn)減少，此時的計算復(fù)雜度大幅下降），可以更快速準(zhǔn)確地分離出我們所需要的端元點(diǎn)。

3 結(jié)論與展望

在上述實(shí)驗中，我們分別分析了PPI算法和N-FINDR算法在生物熒光成像實(shí)驗中的效果，對比了兩個算法各自的優(yōu)缺點(diǎn)。通過生物熒光染料的實(shí)驗驗證，發(fā)現(xiàn)將兩個算法的優(yōu)點(diǎn)合并使用，可以得到一個更優(yōu)的處理結(jié)果，這一點(diǎn)為實(shí)驗結(jié)果所證實(shí)?？紤]到更復(fù)雜的試驗，由于不同深度的熒光源，在生物體內(nèi)傳播時會發(fā)生散射、折射和反射等現(xiàn)象，導(dǎo)致像素亮度的疊加也可能并不是絕對線性疊加的。另外，圖像中也可能僅存在混合像元點(diǎn)，而不存在純的端元像素點(diǎn)，而上述兩種算法的實(shí)現(xiàn)都要求圖像中必須包含純的端元點(diǎn)才能將其分離。因此，我們計劃在后續(xù)的試驗中嘗試并改進(jìn)其它的譜分離算法來適應(yīng)生物熒光成像的特點(diǎn)，例如盲分離[14]算法可以在圖像中不含有純端元點(diǎn)以及無需預(yù)先估計端元參考光譜的情況下，直接進(jìn)行譜分離來得出各個端元的豐度。

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