牛成偉，曹 凱

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能是否正常與保持通暢的血液循環(huán)，維持正常的血管舒縮狀態(tài)密切相關(guān)，在病理因素作用下發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)因素[1]。采用培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行科學(xué)研究是一種普遍的實(shí)驗(yàn)方法。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)單，能夠獲得較多細(xì)胞數(shù)目，且活力良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 新生兒臍帶：由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基，GIBCO產(chǎn)品；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，澳大利亞；膠原酶Ⅰ，SIGMA公司產(chǎn)品；堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF），美國(guó)E.coli產(chǎn)品；Ⅷ因子相關(guān)抗原、通用SP系列試劑盒、DAB顯色試劑盒為中杉金橋生物技術(shù)有限公司。完全培養(yǎng)基成分：80% DMEM：20%胎牛血清；bFGF，20ng/ml；青霉素，100U/ml；鏈霉素，0.1g/L。

1.1.3 儀器：HERAcell 150型CO2孵育箱，德國(guó)Heraeus公司；LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡，德國(guó)Wetzlar GmbH公司；凈化工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下取新生兒臍帶約25cm，剪去兩端夾痕，擠出殘留血液，PBS沖洗至沖洗液無色。將血管下端夾緊，注入0.1%膠原酶Ⅰ與0.25%胰酶、0.02%EDTA（V/V=1:1）的混合消化酶至靜脈充盈，置37℃溫箱中消化13min。收集消化液于錐形瓶，迅速加2ml小牛血清終止消化；并用D-Hanks液沖洗臍靜脈，將沖洗液一并收集在錐形瓶中，離心10min；棄上清，加入完全培養(yǎng)液5ml，混勻后接種于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24h更換培養(yǎng)液，以后每隔2d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)80%以上融合時(shí)，加入0.125%胰酶、0.01%EDTA，常溫下消化。鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞變圓，立即加入含血清的培養(yǎng)液滅活，停止消化。用吸管輕輕的吹打，使仍貼壁的細(xì)胞脫落，離心。棄上清液，加入2ml完全培養(yǎng)基，制成均勻的細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，按密度1.0×105個(gè)/ml接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：將培養(yǎng)的細(xì)胞接種到預(yù)先放入多聚賴氨酸包被過的蓋玻片的培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，終止培養(yǎng)。丙酮固定10min，3%H2O2浸泡30min，山羊血清封閉，加入兔抗人Ⅷ因子IgG抗體（一抗）4℃過夜，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片后顯微鏡下觀察。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 原代細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，邊界清楚，形態(tài)為卵圓形。培養(yǎng)3-4d融合，呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。傳代細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)與原代細(xì)胞類似。

2.2 人第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測(cè) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒，胞核為藍(lán)色，說明細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)皮細(xì)胞特有的第Ⅷ因子相關(guān)抗原存在；對(duì)照組為陰性反應(yīng)。

3 討論

人臍靜脈作為內(nèi)皮細(xì)胞的材料來源，具有取材容易、操作方便的特點(diǎn)，且與各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，其實(shí)驗(yàn)條件更符合人體情況，結(jié)果更具有意義。在培養(yǎng)細(xì)胞的獲取方法上，有機(jī)械刮取、組織塊移植和酶消化法三種。前兩種易混雜其它血管壁細(xì)胞，近年已逐漸被酶消化法取代[2]。胰蛋白酶、膠原酶均可用于消化血管內(nèi)皮細(xì)胞，但胰蛋白酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷較大；膠原酶作用較溫和，但價(jià)格昂貴，限制了其在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用。本研究采用胰蛋白酶、膠原酶等比混和消化液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行消化，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

本研究認(rèn)為，影響細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)和融合的因素包括：①臍帶應(yīng)新鮮，取下后立即放入冷D-Hanks液中，在4h內(nèi)完成內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，有利于細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)。②掌握消化酶的濃度和時(shí)間非常重要。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)采用膠原酶Ⅰ與胰蛋白酶、EDTA等比混和消化液分別消化8min、13min和18min，發(fā)現(xiàn)消化13min，獲取的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量最多，而成纖維細(xì)胞和平滑細(xì)肌細(xì)胞則較少被消化下來，且內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖狀態(tài)良好。③人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是一種低增殖能力的細(xì)胞，需加入生長(zhǎng)刺激因子以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。其它研究者的實(shí)驗(yàn)，多添加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能專一性的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴，很難推廣應(yīng)用[3]。本研究加入價(jià)格低廉的bFGF。bFGF是一種多效能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，增強(qiáng)有絲分裂活性[4]。

綜上所述，本研究的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定的方法簡(jiǎn)捷易行，成功率較高，能獲得大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞，能很好地滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要。

[1]Mallika V,Goswami B,Rajappa M.Atherosclerosis pathophysiology and the role of novel risk factors:a clinicobiochemical perspective[J]. Angiology,2007,58（5）:513-522.

[2]王立巖，佟曉紅，宮桂蘭，等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)觀察[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26（1）：26-28.

[3]Plouet J,Moro F,Bertagnolli S,et al.Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is required for its mitogenic effect[J].J BiolC hem,1997,272:13390-13396.

[4]Sohn YD,Lim HJ,Hwang KC,et al.A novel recombinant basic fibroblastgrowth factor and its secretion[J].Biochem Biophys Res Commun, 2001,284（4）:931-936.