劉富來，馮翠蘭

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231）

1 材料與方法

1.1 金黃色葡萄球菌和小鼠

金黃色葡萄球菌菌株（SEF101）由本校食品科學(xué)實驗室從典型病例中分離，金黃色葡萄球菌檢測參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗》GB/T4789.10-2003進行[3]和 VIDAS法腸毒素實驗，鑒定為產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌。18-22日齡KM小鼠（SPF級），雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2003-002，粵監(jiān)證字2008A022。實驗前置室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境7天，室溫20-29℃，采用架式籠養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲水為自來水，實驗前禁飼12小時。

1.2 儀器和試劑

全自動熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀(SpectraMax M2e)，Molecular Devices生產(chǎn)；YLN-30電腦控制菌落計數(shù)器，北京亞力恩科學(xué)器材公司生產(chǎn)；葡萄球菌腸毒素SET檢測試劑盒，上海博舜生物科技有限公司提供。普通營養(yǎng)瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂(SP)和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。顯微鏡，培養(yǎng)皿。

1.3 感染菌液的制備

挑取生長在SP平板上的金黃色葡萄球菌菌株（SEF101）單菌落，接種于5mL營養(yǎng)肉湯中37℃搖振(100r/min)培養(yǎng)20h，然后將陳舊菌液加入45mL新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)物，同時采用平板表面涂布法和YLN-30電腦控制菌落計數(shù)器進行活菌計數(shù)，計算實際含菌量，確定所收集培養(yǎng)物含菌量為6.6×109CFU/mL，將肉湯分為A、B兩份，A=10mL，B=40mL。

1.3.1 不同稀釋度肉湯制備

按10倍稀釋法將肉湯A作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度稀釋，備用。

1.3.2 細菌滅活處理

肉湯B再分為兩等份，把其中一份于80℃滅菌30min，另一份不作處理，可得不滅活的肉湯培養(yǎng)物和滅活的肉湯培養(yǎng)物各1份。將滅活處理后的肉湯，以平板劃線培養(yǎng)24h不長菌為標(biāo)準(zhǔn)檢驗滅菌效果。

1.4 酶標(biāo)免疫法檢測腸毒素

嚴(yán)格按全自動熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀的操作規(guī)程進行上機檢測肉湯B的2份培養(yǎng)物，采用全自動酶標(biāo)免疫測試系統(tǒng)以熒光酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測其腸毒素。

“千淘萬漉雖辛苦，吹盡狂沙始到金”，以大道之行、天下為公為使命，在歷史上鐫刻下一個個不可磨滅的青春印記。先行者青春之信念和青春之行動，奔騰于歷史，涌動于血液，傳承于后人，傳承于石化。

1.5 動物分組及感染

1.5.1 金黃色葡萄球菌致死小鼠實驗

將77只小白鼠稱重標(biāo)記，隨機分為7組，每組11只，1-6組為實驗組，依次為第1組肌注不滅活的菌液，第2組肌注經(jīng)滅活處理的菌液，第3組腹腔注射不滅活的菌液，第4組腹腔注射經(jīng)滅活處理的菌液，第5組尾靜脈注射不滅活的菌液，第6組尾靜脈注射經(jīng)滅活處理的菌液，用肉湯B菌液，每只鼠染菌劑量為0.5 mL；第7組為對照組，肌注0.5mL滅菌生理鹽水。

1.5.2 腹腔注射感染劑量實驗

將77只小白鼠稱重標(biāo)記，隨機分為7組，每組11只，1-6組為實驗組，分別經(jīng)腹腔注射接種10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的肉湯A菌液0.5mL，第7組為對照組，腹腔注射0.5mL滅菌生理鹽水。

1.6 樣本的采集及處理

感染后每隔4h觀察1次，觀察7d，觀察發(fā)病鼠的精神狀態(tài)和外觀體況并記錄鼠的發(fā)病、死亡情況，作好統(tǒng)計、整理；及時剖殺死鼠，觀察其組織器官的病理變化；無菌取病死鼠的心臟、肝臟和腎臟等組織涂片、觸片，革蘭染色鏡檢，同時用SP進行選擇培養(yǎng)；試驗結(jié)束時撲殺所有剩余的鼠，取試驗組及對照組小鼠的心臟、肝臟和腎臟等組織器宮，以中性甲醛固定，按常規(guī)方法制作組織切片，H·E染色，觀察病理組織學(xué)變化。

1.7 死亡鼠細菌鑒定

感染動物死亡后，用無菌方式采取動物的內(nèi)臟制作觸片，自然干燥后革蘭氏染色，鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸毒素檢測結(jié)果

腸毒素檢測結(jié)果見表1。所有肉湯B腸毒素檢測均呈陽性反應(yīng)，表明金黃色葡萄球菌菌株（SEF101）肉湯培養(yǎng)24h可產(chǎn)生腸毒素。

2.2 小鼠死亡情況

2.2.1 金黃色葡萄球菌致死小鼠實驗

各組小鼠死亡時間和數(shù)量的情況見表1。經(jīng)滅活處理的肉湯培養(yǎng)物，致小鼠死亡集中在兩天內(nèi)，說明金黃色葡萄球菌（SEF101）在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了一些可致小鼠死亡的物質(zhì)；不經(jīng)滅活處理肉湯培養(yǎng)物，可致全部小鼠死亡，呈第1天和第3天兩個死亡高峰，初步猜測前一個高峰為培養(yǎng)物中致死物質(zhì)直接導(dǎo)致小鼠死亡，后一個高峰為細菌感染小鼠后引起死亡。

2.2.2 腹腔注射感染劑量實驗

各稀釋度小鼠死亡情況見表2。稀釋度＜10-4即可引起小鼠感染死亡，原培養(yǎng)物含菌量為6.6×109CFU/mL，每只腹腔注射菌液0.5mL，表明每只小鼠染菌量＞3.3×105CFU即可引起小鼠感染死亡。

2.3 細菌鑒定

經(jīng)滅活處理的肉湯培養(yǎng)物所致死小鼠內(nèi)臟未分離到接種菌；未經(jīng)滅活處理的各組死亡鼠均分離大量均勻一致，單個、成對或不規(guī)則排列成葡萄串狀的革蘭氏陽性球菌，特征與所接種的病原菌一致，說明金黃色葡萄球菌（SEF101）可感染小鼠并致小鼠死亡。

2.4 臨診癥狀

病鼠初期大多表現(xiàn)精神不振，采食、飲水減少，部分病鼠蜷縮于一角。病情加重后，病鼠呼吸困難，顏面部發(fā)紺，接種處皮下呈青紫色。后期病鼠極度衰弱，接種處出現(xiàn)化膿性病變，病鼠相互擁擠在一起不愿活動，最后衰竭死亡。對照組鼠未見異常癥狀。

2.5 剖檢病變

病鼠各組織器官出現(xiàn)廣泛病變。肺淤血、水腫；肝臟淤血、腫大；脾臟腫大、壞死，在表面和切面上可見多個大小不等的壞死灶；腎臟腫大、色淡；胃粘膜水腫增厚，粘膜下或表面出現(xiàn)膿性潰瘍灶；腸系膜和漿膜的小血管擴張、充血，腸粘膜有小的出血點或出血斑。對照組鼠肉眼未見異常病變。

2.6 病理觀察

各組死亡小鼠，病理變化差異不大，脾臟呈明顯腫大。肝臟腫大，肝細胞顆粒變性、腫脹，見圖1至圖2。心臟、腎臟和肺臟也有不同程度病變。

3 討論

本研究試圖通過80℃滅菌30min處理金黃色葡萄球菌（SEF101）肉湯培養(yǎng)物，與未經(jīng)處理的培養(yǎng)物比較，觀察接種小鼠的死亡情況，判斷該菌能否產(chǎn)生對小鼠致死的毒素。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌（SEF101）能產(chǎn)生導(dǎo)致小鼠死亡的毒素，所有培養(yǎng)物VIDAS法檢測呈腸毒素陽性，可以肯定該菌能夠產(chǎn)腸毒素，但本研究并未對腸毒素類型進行鑒定。

經(jīng)典的腸毒素動物學(xué)試驗方法是采用幼貓和猴作為研究對象，腹腔注射或喂食肉湯培養(yǎng)物或嘔吐物，然后觀察動物可能出現(xiàn)的各種異常的生理或形態(tài)變化，一般4h內(nèi)受試動物發(fā)生嘔吐腹瀉和體溫升高或死亡等現(xiàn)象者，提示SE存在。小鼠、家兔、豬、狗等其他動物均對SE不敏感或感應(yīng)性差，無特異性，實用價值低[4]。本研究的結(jié)果與上述觀點不同，從實驗結(jié)果看，小鼠對金黃色葡萄球菌（SEF101）比較敏感，最小染菌劑量為每只小鼠染菌量＞3.3×105CFU即可引起小鼠感染死亡。人工接種后具有明顯的臨床癥狀和病理學(xué)變化，說明小鼠可作為金黃色葡萄球菌感染的實驗動物，這給制備動物模型進行臨床治療藥物的篩選提供了良好的動物模型，為進一步探討金黃色葡萄球菌的致病機理及疫苗的研制奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，小鼠對金黃色葡萄球菌高度敏感，最小染菌劑量為＞3.3×105CFU/只，小鼠可作為金黃色葡萄球菌感染的實驗動物；金黃色葡萄球菌（SEF101）肉湯培養(yǎng)24h可以產(chǎn)生致死小鼠的毒素，這些毒素經(jīng)80℃30min處理仍具有活性，毒素中含腸毒素；金黃色葡萄球菌（SEF101）所產(chǎn)生的腸毒素類型有待進一步研究。

[1]張嚴(yán)峻，張俊彥.金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分型和分布[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15(6):682-684.

[2]張雯霞，陳敏，席曼芳，等.金黃色葡萄球菌腸毒素實驗分析 [J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，20(4):186-188.

[3]GB/T4789.10-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[4]楊彩娟，蔣志勇，陳德坤，等.豬葡萄球菌感染裸鼠及BALB/c小鼠模型的研究 [J].中國動物檢疫，2008，25（5）：26-28.