康福忠，張 勇，王立紅，董惠鋒，劉鼎闊*

（1.天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津 300402；2.鼎正動物藥業(yè)（天津）有限公司，天津 300402）

乳糖酶在食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖飼料等方面具有廣泛的應(yīng)用價值，但由于受乳糖酶發(fā)酵工藝的復(fù)雜性限制，致使其并未能夠得到大規(guī)模的生產(chǎn)和使用。本試驗利用亮毛霉固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)生乳糖酶，分析不同條件對其產(chǎn)酶效果的影響，確定了固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)酶的最佳工藝路線，以期為乳糖酶的生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 儀器設(shè)備

J-25型高速冷凍離心機、DL201型恒溫自動干燥箱、BS-2F恒溫振蕩培養(yǎng)箱、HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、JA2003電子天平、DZKW-C型水浴鍋、蒸氣消毒器、Delta 320 pH計。

1.2 試驗材料

亮毛霉（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖等。

2 試驗方法

2.1 固體培養(yǎng)基制備

將麩皮和蒸餾水、黃豆粉和蒸餾水、玉米粉和蒸餾水分別按1：1混合放入250 mL三角瓶中，其中固體物質(zhì)定量為10 g，攪拌均勻，分別作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基1、2、3。進(jìn)行高壓滅菌，冷卻后制備菌懸液，將已接種的三角瓶放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行3～5 d培養(yǎng)。

2.2 粗酶液的制備

用8倍體積的水浸提發(fā)酵過的麩皮，并勻速攪拌30 min。經(jīng)4層紗布過濾后即得粗酶液，靜置取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 乳糖酶提取

硫酸銨分級沉淀法：將硫酸銨烘干研細(xì)，取200 mL上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其濃度達(dá)20%， 4℃ 靜置2 h，4℃，7 000 rpm離心 15 min），沉淀溶于 0.005 mol·L-1、pH 6.28 的磷酸鹽緩沖液，測定酶活力。上清液繼續(xù)加入硫酸銨粉末至濃度達(dá)40%，靜置離心，沉淀溶于緩沖液，測定酶活力。

2.4 固體培養(yǎng)的單因素試驗

2.4.1 確定最佳碳源

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以0.04 g·mL－1的比例加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉，制備菌懸液接種培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)情況，并測定酶活力以確定最佳的外加碳源。

2.4.2 確定最佳氮源

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以0.02 g·mL－1的比例加入蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、氯化銨、硝酸銨，制備菌懸液接種培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)情況，并測定酶活力以確定最佳的外加氮源。

2.4.3 無機鹽

在選中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別按0.1%的比例加入ZnCl2、Al2（SO4）3、CaCl2、FeCl2、CuSO4、MnSO4、KH2PO4，制備菌懸液接種培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)情況，并測定酶活力。

2.4.4 固液比

培養(yǎng)基的固液比分別為 1： 0.5、1：1、1： 1.5、1：2、1：2.5，在其中接入21 mL孢子懸液，觀察培養(yǎng)情況，并測定酶活力以確定最佳的固液比。

2.4.5 改變接種量

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別接菌懸液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，制備菌懸液接種培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)情況。并測定酶活力以確定最佳的接種量。

3 結(jié)果與分析

3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對乳糖酶產(chǎn)量的影響見圖1。

圖1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對乳糖酶產(chǎn)量的影響

由圖1可知，用麩皮和水的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)實驗室霉菌產(chǎn)生的乳糖酶活力最高，并且麩皮價格低廉，來源穩(wěn)定，在未來擴大化培養(yǎng)和乳糖酶工業(yè)化生產(chǎn)中也適合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。大豆粉和玉米粉在加入水發(fā)酵培養(yǎng)后容易形成黏稠固形物，不適合后期乳糖酶的分離提取。故麩皮最適合亮毛霉進(jìn)行固體培養(yǎng)。麩皮之間的空隙較大，有利于氧氣的流通，適合進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)。

3.2 外加碳源對乳糖酶產(chǎn)量的影響

外加碳源對乳糖酶產(chǎn)量的影響見圖2。

碳源是菌體細(xì)胞組成的原料，也是菌體生長發(fā)育必需的能源物質(zhì)。某些碳源是酶的誘導(dǎo)物，選擇適宜的碳源有利于定向促進(jìn)某些酶的合成，提高相應(yīng)酶的產(chǎn)量[1]。

由圖2可知，麥芽糖、蔗糖對乳糖酶的生成都無明顯作用，可溶性淀粉和葡萄糖對乳糖酶的生成有一定抑制作用，而乳糖的加入則略微促進(jìn)了乳糖酶的生成。符合乳糖操縱子學(xué)說，因此選擇乳糖作為乳糖酶固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的外加碳源。

3.3 外加氮源對乳糖酶產(chǎn)量的影響

外加氮源對乳糖酶產(chǎn)量的影響見圖3。

圖2 外加碳源對乳糖酶產(chǎn)量的影響

圖3 外加氮源對乳糖酶產(chǎn)量的影響

氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素之一。通常分為無機氮源和有機氮源，不同的氮源對產(chǎn)酶能力有不同的影響，一般來說，有機氮源對菌體的生長產(chǎn)酶較為有利，而菌體對無機氮源的利用則較差[2]。由圖3可知，外加氮源中，3種有機氮源的加入都對乳糖酶的產(chǎn)生起到促進(jìn)作用，其中蛋白胨的效果最明顯。而無機氮源，在一定程度上抑制了乳糖酶的產(chǎn)生。故外加氮源選擇蛋白胨比較合適。

3.4 不同無機鹽的添加對乳糖酶產(chǎn)量的影響

無機鹽對乳糖酶合成的影響見圖4。

除了碳源和氮源外，一些常量元素和微量元素也影響菌體的生長和酶的形成[3]。

圖4 無機鹽對乳糖酶合成的影響

由圖4可見，培養(yǎng)基中添加KH2PO40.1%時最有利于乳糖酶的產(chǎn)生。ZnCl2和CuSO4的加入抑制了乳糖酶的產(chǎn)生。因此選取KH2PO4添加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基以增加乳糖酶的產(chǎn)量。

3.5 固液比對乳糖酶產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基固液比對乳糖酶產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 培養(yǎng)基固液比對乳糖酶產(chǎn)量的影響

固液比不同，相應(yīng)的乳糖酶的產(chǎn)量也不同。當(dāng)加水量過低時，水分缺乏，不足以提供微生物生長所必需，故菌體生長緩慢，相應(yīng)的產(chǎn)酶量較低；當(dāng)加水量過高時，水分過多，不利于空氣的流通，影響酶的產(chǎn)量。由圖5可知，隨著固液比的增高，乳糖酶活力先增后減。其中當(dāng)固液比為 1：1.5時，乳糖酶產(chǎn)量最高。

3.6 接種量對酶產(chǎn)量的影響

接種量對乳糖酶產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6 接種量對乳糖酶產(chǎn)量的影響

由圖6可知，在一定范圍內(nèi)酶的產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加，這個范圍的臨界點為10%～15%。故接種量在這個臨界點附近時，酶的產(chǎn)量相對較高。

4 小結(jié)

乳糖酶在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域中的應(yīng)用具有廣闊的前景，已經(jīng)成為生物領(lǐng)域新的熱點之一，但由于乳糖酶的生產(chǎn)、純化等過程比較困難，所以一直以來乳糖酶未能得到廣泛應(yīng)用。固態(tài)發(fā)酵工藝是一門很古老的技術(shù)，已在眾多的領(lǐng)域得到應(yīng)用，利用固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行各種酶類的生產(chǎn)已經(jīng)成為常用的技術(shù)手段。所需的設(shè)備簡單，便于生產(chǎn)，各領(lǐng)域上都得到了很大發(fā)展。隨著人們對固態(tài)發(fā)酵機理認(rèn)識不斷加深，固態(tài)發(fā)酵中存在的一些問題也有望逐步得到解決和完善，使利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行酶的大規(guī)模生產(chǎn)完全成為可能。尤其在能源危機和環(huán)境問題日益突出的今天，固態(tài)發(fā)酵作為一種綠色生產(chǎn)工藝，將會有更加廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步也將促進(jìn)工業(yè)發(fā)酵水平的不斷完善與提高，使工業(yè)化生產(chǎn)向著綠色、環(huán)保、安全的方向發(fā)展。

[1]姚躍飛,曾柏全.現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵技術(shù)在食品加工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品與機械,2005（6）:89-92.

[2]俞俊裳.新編生物工藝學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003.

[3]李興峰.乳糖酶高產(chǎn)菌株分離篩選、發(fā)酵產(chǎn)酶及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.