夏少秋 朱 穎 趙 越 廣東藥學院中藥學院(廣州 510006)

果蠅衰老的進程中會出現(xiàn)觸角,腿以及部分翅膀的損傷,而這些損傷會造成血淋巴的丟失,血淋巴含有水和營養(yǎng)物質(zhì),這些物質(zhì)可能是果蠅生存的必要物質(zhì)[1]。本實驗人為造成果蠅腿損傷,可能提前使果蠅進入衰老狀態(tài)。再用六味地黃生物制劑喂飼這些損傷的果蠅,考察其能否延緩衰老。

六味地黃丸能滋陰補腎,用于腎陰虧損,頭暈耳鳴,腰膝酸軟,骨蒸潮熱,盜汗遺精,消渴[2]。研究表明 ,六味地黃方能改善機體自由基代謝,增強機體免疫機能,補充機體必需物質(zhì),抗DN A損傷作用,改善學習記憶能力,從而起到延緩衰老的作用[3]。六味地黃生物制劑 (LiuweidihuangDecoction Metabolized by Photosynthetic bacteria,簡稱 LW-PSB)是通過光合細菌代謝傳統(tǒng)的六味地黃湯,既能增強其抗衰老的作用,又因添加了光合細菌使得該生物制劑營養(yǎng)更豐富。本實驗是前期研究表明六味地黃生物制劑的抗衰老作用明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的六味地黃湯。本實驗研究其對殘疾的雄性果蠅衰老的影響[4]。

1 方法和材料 1.1 器材與試劑白砂糖、瓊脂、玉米粉、酵母粉(均為食品級 );丙酸 (均為分析純);恒溫生化培養(yǎng)箱BOXUN SPX-250B-Z型(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)等。

1.2 六味地黃生物制劑的制備 熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓按處方的比例(8:4:4:3:3:3)配藥。加 8倍量的水,文火煎煮 1.5h,濾過。藥渣再加 6倍量的水煎煮 1.5h,濾過。合并濾液,濃縮至 0.5g/mL備用。按上述方法制備的六味地黃湯經(jīng)自然發(fā)酵后,按一定比例加入光合細菌代謝 6個月即得。

1.3 培養(yǎng)基的制備 1.3.1 普通培養(yǎng)基制備:水 180 mL,白糖 13 g,瓊脂 1.3 g,玉米粉 17 g,酵母粉 1.4 g,丙酸 1mL。

1.3.2 含藥培養(yǎng)基制備:分別取 LW-PSB0.1g,0.2g加入到 100 g普通培養(yǎng)基中,得到濃度為 0.1%,0.2%的含藥培養(yǎng)基。

1.4 動物 美國野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster),溫度為 (25± 1)℃ ,相對濕度為 (60± 5)% 環(huán)境,12 h光照,12 h黑暗交替培養(yǎng)。

1.5 實驗方法 1.5.1 交配實驗:收集 8 h內(nèi)新羽化黑腹雄雄性果蠅成蟲,低溫麻醉 ,做如下處理:組Ⅰ剪去果蠅一側(cè)中足全腿;組Ⅱ剪去果蠅兩側(cè)中足腿尖;組Ⅲ果蠅不做任何處理。每組 10只果蠅,普通培養(yǎng)基飼養(yǎng) 20d。于第 21天將雌雄合并,合并方法:Ⅰ雄性果蠅和正常雌性果蠅;Ⅱ雄性果蠅和正常雌性果蠅;Ⅲ雄性果蠅和正常雌性果蠅。從合并開始計時,記錄 11 min內(nèi) ,22 min內(nèi),33 min內(nèi),44 min內(nèi)交配的總數(shù)。每組重復實驗 10次。

1.5.2 抗凍實驗:收集 8h內(nèi)新羽化黑腹雄性果蠅成蟲,低溫麻醉,果蠅處理方法同 1.5.1。每組 50只果蠅 ,普通培養(yǎng)基飼養(yǎng) 10d。于第 11天移入空的三角瓶中,置于-5℃環(huán)境中 4.5h,再與室溫下 (14℃)復活 6h,觀察果蠅存活只數(shù)。每組重復實驗10次。

1.5.3 攀爬實驗:收集 8h內(nèi)新羽化黑腹雄性果蠅成蟲,低溫麻醉,果蠅處理方法同 1.5.1。每組 50只果蠅,普通培養(yǎng)基飼養(yǎng) 30d。于第 31天移入空的三角瓶中 ,再在其上覆蓋一個空的三角瓶,觀察 30min內(nèi)攀爬上覆蓋瓶中的果蠅只數(shù)。每組重復實驗 10次。

1.5.4 壽命實驗:收集 8 h內(nèi)新羽化黑腹雄性果蠅成蟲,低溫麻醉,果蠅處理方法同 1.5.1。每組果蠅 100只。每 2天更換新鮮培養(yǎng)基。實驗開始后,每天定點觀察,記錄果蠅死亡數(shù),直到各組果蠅全部死亡為止。全部果蠅壽命的算術平均數(shù)為平均壽命,最后 10只果蠅壽命的算術平均數(shù)為最高壽命,前一半死亡的果蠅的壽命的算術平均數(shù)為半數(shù)死亡時間。平均延壽率(%)=(給藥組平均壽命-空白對照組平均壽命)/空白對照組平均壽命×100%。統(tǒng)計各組果蠅平均壽命,最高壽命,半數(shù)死亡時間和平均延壽率。

1.6 統(tǒng)計學方法采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果 2.1 交配實驗

表1 損傷對雄性果蠅交配行為的影響 (.D)

表1 損傷對雄性果蠅交配行為的影響 (.D)

與組Ⅲ比較:△P＜0.05;▲P＜0.01;◇P＜0.001。

組別 交配對數(shù) /對11min 22min 33min 44minⅠ 0.67± 0.52▲ 1.00±0.89△ 1.50±0.84◇ 2.00±0.89◇Ⅱ 0.83± 0.75△ 1.50±0.55▲ 1.83±0.98▲ 2.50±1.05▲Ⅲ 2.00± 0.63 2.83± 0.75 4.00± 1.09 4.33± 0.82

從表 1可知,從 11 min到 44 min,組Ⅰ ,Ⅱ與組Ⅲ比較 ,組Ⅰ,Ⅱ的交配能力明顯弱于組Ⅲ (P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001)。這可能與果蠅腿損傷后,行動不便有關 ,還有與果蠅的交配方式有關。

2.2 耐寒實驗

表2 損傷對雄性果蠅耐寒能力的影響 (.D)

表2 損傷對雄性果蠅耐寒能力的影響 (.D)

與組Ⅲ比較:△ P＜0.01。

組別 存活數(shù) /只 平均存活率/%Ⅰ7.60± 6.99△ 15.2Ⅱ7.60± 6.55△ 14.6Ⅲ19.20±9.24 38.6

從表 2可知,組Ⅰ ,組Ⅱ與組Ⅲ比較均有顯著性差異(P＜0.01),說明損傷的雄性果蠅抵御低溫的能力比正常雄性果蠅低,可能是損傷引起內(nèi)分泌失調(diào)有關。

2.3 攀爬實驗

表3 損傷對雄性果蠅攀爬能力的影響 (.D)

表3 損傷對雄性果蠅攀爬能力的影響 (.D)

注:與組Ⅲ比較,△P＜0.001。組Ⅰ ,組Ⅱ與組Ⅲ比較均有顯著性差異(P＜0.001)。

組別 攀爬數(shù) /只 平均攀爬率/%Ⅰ13.83± 4.45△ 27.7Ⅱ13.00± 4.69△ 19.3Ⅲ29.33±7.58 58.7

2.4 壽命實驗

表4 六味地黃生物制劑對雄性殘疾果蠅壽命的影響(.D)

表4 六味地黃生物制劑對雄性殘疾果蠅壽命的影響(.D)

與空白組比較:△P＜0.05;▲ P＜0.01;◇P＜0.001。

表 4可知,LW-PSB各濃度均能提高 2種損傷雄性果蠅半數(shù)死亡時間,并顯示出及其顯著的差異(P＜0.001)。另外,LW-PSB 0.2% 濃度組能顯著延長 2種損傷雄性果蠅的平均壽命(P＜0.01,P＜0.001),并且延壽率達到 44.8%,24.2%。 LW-PSB各濃度組能顯著提高模型一的最高壽命(P＜0.05,P＜0.001),但對模型二沒有明顯作用。另外,隨著濃度的增加,抗衰老的效果也有增加的趨勢。說明 LW-PSB不但能延緩衰老,而且能扭轉(zhuǎn)果蠅衰老的狀態(tài),增強的生命活力。

3 討 論 衰老是生物體在生命周期中隨著年齡增長而發(fā)生的全身各組織器官功能衰退和穩(wěn)態(tài)功能下降的過程,是機體各種生化反應的綜合表現(xiàn)。人體衰老與機體細胞凋亡、免疫功能狀態(tài)有著密切關系[5]。在衰老與抗衰老研究中,果蠅以其自身的諸多優(yōu)勢如高度純種,培育簡單,生存期短,繁殖能力強,觀察指標明顯,因而是研究抗衰老的好材料[6]。

本研究顯示六味地黃生物制劑對殘疾雄性果蠅的壽命、生殖能力、攀爬能力、耐寒能力均有明顯的作用。從實驗 1-3可以得出,殘疾的雄性果蠅無論是交配能力,耐寒能力或者攀爬的能力都不及正常的雄性果蠅,而且都顯示出顯著性差異(P＜0.05)。這可能意味著人為造成果蠅殘疾可以使果蠅提前進入衰老的過程。這些人為的傷害直接使果蠅行動不便,也可能直接或間接得使果蠅的代謝方面產(chǎn)生變化。所以,不管殘疾果蠅是否真的提前進入衰老期,它們都要弱勢于正常果蠅。

我們將質(zhì)量濃度為 0.1%,0.2%的 LW-PSB喂飼這些殘疾的果蠅,從實驗 4可以看出,LW-PSB起到了很好的延緩衰老的作用。LW-PSB可以扭轉(zhuǎn)殘疾果蠅的弱勢狀態(tài),提高生命活力,使得它們和正常的果蠅擁有一樣的長的壽命,甚至活的更長。綜上實驗表明六味地黃生物制劑具有良好的延緩衰老的作用。鑒于生物衰老的原因和過程十分復雜,六味地黃生物制劑正丁醇提取物延緩衰老作用的其他機理,還需進行多方面的實驗和臨床研究。

[1]Sean Sepulveda,Parvin Shojaeian,Casandra L.Rauser,Mahtab Jafari,Laurence D.Mueller,Michael R.Rose. Interactions between injury, stress resistance,reproduction,and aging in Drosophila melanogaster[M].Experimental Gerontology,2008:43,136-145.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典 [M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:402.

[3]張大祿,范丙義,張 瑜,等.六味地黃方抗衰老作用研究 [J].中醫(yī)藥信息,2001,l8(6):19-21.

[4]王德秀,胡旭光,臧建偉,等.六味地黃湯生物制劑對腎陰虛小鼠 HPA軸的調(diào)節(jié)作用研究[J].陜西中醫(yī),2008,29(3):374-375.

[5]Hindra JS著,肖德楨.老年生物學與醫(yī)學 [M].北京:科學出版社,1980:112.

[6]王厚德.老年學實驗用果蠅飼養(yǎng)方法的研究 [J].老年學雜志,1987,7(2):44.