張露蓉 江國榮 周水英 任光榮 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院(蘇州 215003)

非甾體抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatory drugs,NSAIDs)所致急性胃黏膜病變(acute gastric mucosal lesion,AGM L)是一種以胃黏膜糜爛、潰瘍、出血為主要病理特征的急性應(yīng)激性病變,是臨床上常見的急性胃黏膜病變之一。有報道AGM L約占上消化道出血病因的 31.61%,僅次于消化性潰瘍出血[1]。本文擬觀察臨床治療驗方護胃方對 AGM L模型大鼠的胃粘膜組織病理變化、細胞凋亡與增殖指標的影響,初步探討護胃方預(yù)防 AGM L的作用及其可能的機制。

1 實驗材料 1.1 藥物 護胃方水煎液:由生大黃、三七、龍膽草、吳茱萸等組成,飲片由蘇州春暉堂中藥飲片廠提供,實驗室自行提取;吲哚美辛腸溶片:江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司,國藥準字 H32021431;水合氯醛:蘇州大學(xué)附兒院制劑室,批號:200707;ED-T A-Na2? X(H2O):上海山浦化工有限公司,批號:39161;T UN EL、蛋白酶 K、SP超敏濃縮試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司;Bcl-2、Bax、PCNC抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 SN-697全自動放免計數(shù)器,上海原子核研究所日環(huán)光電儀器有限公司;冷凍高速離心機,美國 Beckman公司;瑯珈病理圖像分析系統(tǒng)。

1.3 動物 清潔級健康雄性 SD大鼠 50只,體重 250～300g,由浙江省實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙 )2003-0001。

2 實驗方法 2.1 動物的分組將 50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,按體重隨機分為 5組:正常對照組、AGM L模型組、護胃方 3個劑量組,每組 10只。

2.2 消炎痛胃黏膜損傷模型的制備參照文獻[2-3],實驗動物以 40mg? kg-1吲哚美辛混懸液灌胃大鼠,3h后胃黏膜損傷模型制備成功。

2.3 給藥方法[4]正常對照組和模型組每天以蒸餾水灌胃,護胃方低、中、高 3個劑量組分別給予 1.125g生藥? kg-1、2.250g生藥? kg-1、4.500g生藥? kg-1的護胃方水煎液灌胃。灌胃量均按 10mL? kg-1折算,每天 1次,連續(xù) 5d。各組別在第5d給藥前禁食不禁水 12h,第 5天末次給藥 1h后:正常對照組給予以 0.5%羥甲基纖維素鈉蒸餾水灌胃,其它組以 40mg?kg-1吲哚美辛混懸液 (溶劑為 0.5%羥甲基纖維素鈉)灌胃造模。

2.4 標本采集及處理 各組大鼠灌胃消炎痛造模 3h后,以水合氯醛(300mg? kg-1)腹腔注射麻醉,開腹取胃,沿胃大彎剪開,取病變區(qū)胃竇胃粘膜組織-80℃保存;余胃固定于10%的中性緩沖甲醛溶液中。取胃腺區(qū)組織塊 0.5cm×0.5cm,固定、包埋,酒精梯度脫水,制作石蠟病理組織切片,片厚 8 μm。另取腺胃區(qū)組織塊 0.5cm×0.5cm,固定、脫水后在恒溫箱切片機內(nèi)作冰凍切片,片厚 10 μm。

2.5 各項指標的檢測方法 2.5.1胃黏膜肉眼觀察:肉眼觀察胃粘膜表面情況,顯微鏡下拍照,觀察有無充血,水腫,糜爛,出血等情況。

2.5.2 胃黏膜病理觀察:采用常規(guī)的 HE染色法 ,光鏡下觀察胃粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu),并且進行胃粘膜炎癥評定,對每一張病理切片做診斷評估。胃粘膜炎癥分級積分參照 Rauws分級標準[5]:粘膜固有層炎癥細胞、單核細胞、浸潤的密度 0～2分;粘膜固有層嗜中性多核粒細胞浸潤的密度 0～3分;粘膜上皮內(nèi)嗜中性多核粒細胞的密度 0～3分;淺表糜爛的程度 0～2分。每個參數(shù)的打分標準為:0是沒有,1是輕度,2是中度,3是重度。應(yīng)用總分 0～10的變化來衡量胃黏膜炎癥的程度。

2.5.3 采用 TUN EL(原位末端標記法)檢測凋亡指數(shù)(AI):按照試劑盒說明操作,以 PBS代替 TdT為陰性對照。凋亡結(jié)果判定:細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者均為凋亡細胞。由專人肉眼隨機觀察 5個高倍視野,分別記錄凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù),計算凋亡指數(shù)(apoptosis index.AI)=凋亡細胞數(shù) /總細胞數(shù)×100%。

2.5.4 免疫組化法 (SP法)檢測細胞凋亡基因 bcl-2和Bax的表達與增殖細胞核抗原(PCN A)的表達按試劑盒說明操作。光鏡下以細胞染色呈棕黃色為陽性細胞,隨機觀察 5個高倍視野,分別記錄陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù),胃黏膜染色陽性率=陽性細胞數(shù) /總細胞數(shù)×100%。

3 實驗結(jié)果 3.1 胃黏膜肉眼觀察結(jié)果 正常大鼠胃黏膜色澤紅潤,未見損傷性改變。模型大鼠胃腔內(nèi)見血性積液,粘膜表面附有大量血痂,用無菌紗布擦拭后,見粘膜充血水腫明顯,腺胃部彌漫點線狀出血灶。護胃方高、中劑量組大鼠粘膜可見少量糜爛、出血點,其損傷程度均輕于模型組,護胃方低劑量組與模型組差異不明顯。

3.2 胃黏膜病理學(xué)觀察結(jié)果光鏡下見正常大鼠胃黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,未見損失性改變;模型組大鼠胃粘膜上皮細胞受損、脫落,部分粘膜中斷 ,腺體結(jié)構(gòu)紊亂,期間有大量紅細胞聚集,粘膜層及粘膜下層明顯充血水腫,形成多個大小深淺不等的糜爛面,并有較多炎性細胞浸潤;護胃方高、中劑量組胃黏膜糜爛程度減輕,上皮結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù),與模型組比較粘膜充血水腫減輕,護胃方低劑量組與模型組差異不明顯。

3.3 護胃方對胃黏膜炎癥評分的影響模型組大鼠胃黏膜炎癥積分較正常對照組明顯升高(P＜0.01),說明一定劑量的吲哚美辛灌胃可以造成大鼠 AGM L,提示本實驗 AGM L模型復(fù)制成功。護胃方高、中劑量組的胃黏膜炎癥積分均較模型組下降(P＜0.01);護胃方低劑量組的炎癥積分較模型組降低不明顯(P＞0.05)。各組大鼠胃黏膜炎癥評分統(tǒng)計情況見表 1。

表1 胃黏膜炎癥評分統(tǒng)計表(,n=10)

表1 胃黏膜炎癥評分統(tǒng)計表(,n=10)

與正常對照組比較:△P＜0.01;與模型組比較▲P＜0.01。

3.4 護胃方對胃黏膜凋亡指數(shù)的影響正常對照組大鼠胃黏膜上皮散在有 TUNEL標記陽性細胞,胞核呈棕黃染色,主要位于胃腺底、體部,呈弱陽性表達。模型組可見大量 TUNEL標記陽性的胃黏膜細胞,陽性細胞分布由胃腺底部至粘膜表面呈遞減趨勢,成強陽性表達 (胃黏膜凋亡增強),這與文獻[3]報道一致。各用藥組亦可見 TUNEL標記陽性的陽性細胞,較模型組有不同程度的減弱趨勢。胃黏膜細胞凋亡指數(shù)統(tǒng)計分析(見表 2),模型組凋亡指數(shù)較正常對照組顯著增多(P＜0.01);護胃方各劑量組凋亡指數(shù)較模型組均呈現(xiàn)不同程度的減少(P＜0.01)。

表2 大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)統(tǒng)計表(,n=10)

表2 大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)統(tǒng)計表(,n=10)

與正常對照組比較:△P＜0.01;與模型組比較▲P＜0.01。

3.5 護胃方對凋亡調(diào)控基因 Bcl-2和 Bax蛋白表達的影響正常對照組胃黏膜組織中 Bcl-2蛋白的表達主要在胃腺區(qū),呈散在分布,細胞著色較淺,呈中等陽性表達,胞漿呈棕黃染色;在模型組中 Bcl-2蛋白的表達減弱,呈弱陽性,較正常對照組顯著減少(P＜0.01);而在護胃方高、中劑量組中,Bcl-2蛋白的表達呈增強趨勢,較模型組明顯增多(P＜0.01),以護胃方高劑量組更為明顯。正常胃黏膜組織中 Bax蛋白主要在上皮細胞層,散在分布 ,呈中等陽性表達,細胞漿呈棕黃染色;在模型中 Bax蛋白的表達增強,呈強陽性,較正常對照組明顯增多(P＜0.01);在護胃方高、中劑量組中 Bax蛋白的表達呈下降趨勢,較模型組表達減少(P＜0.01),同樣以護胃方高劑量更為明顯。見表3。

表3 大鼠胃黏膜中 Bcl-2和 Bax表達的陽性細胞率統(tǒng)計表(,n=10)

表3 大鼠胃黏膜中 Bcl-2和 Bax表達的陽性細胞率統(tǒng)計表(,n=10)

與正常對照組比較:△P＜0.01;與模型組比較 ▲P＜0.01。

組別 給藥劑量 Bcl-2(%) Bax(%)正常對照組 - 19.47±0.59 16.35± 0.59模型組 - 14.11± 0.26△ 50.23± 0.79△護胃方組 1.125g生藥? kg-1 14.03±0.37 46.44±0.612.250 g 生藥? kg-1 15.03± 0.31△ 40.83± 0.59▲4.500 g生藥? kg-1 16.40± 0.47△ 34.55± 0.86▲

3.6 護胃方對細胞核增殖抗原 PCNA表達的影響 正常對照組胃粘膜細胞,PCN A主要在胃腺頸部靠近胃上皮部表達,呈中等陽性表達,胞核呈棕黃染色;模型組 PCNA表達減弱,呈弱陽性表達 ,較正常對照組減少(P＜0.01);護胃方高、中劑量組表達較模型組增強,呈中等陽性表達(P＜0.01)。見表 4。

表4 大鼠胃黏膜中 PCNA表達的陽性細胞率統(tǒng)計表(,n=10)

表4 大鼠胃黏膜中 PCNA表達的陽性細胞率統(tǒng)計表(,n=10)

與正常對照組比較:△P＜0.01;與模型組比較▲P＜0.01。

組別 給藥劑量 PCNA(%)正常對照組 - 28.65± 0.53模型組 - 17.07± 0.39△護胃方組 1.125g生藥? kg-1 17.94± 0.412.250g生藥? kg-1 20.36± 0.34▲4.500 g生藥? kg-1 22.74± 0.32▲

4 討 論 AGML的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的、多因素綜合的過程,大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明,其發(fā)病機制除 H+的逆擴散、胃黏膜微循環(huán)障礙、氧自由基的損傷作用,神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)及前列腺素等物質(zhì)的保護作用減弱外,胃黏膜完整性的維持需依賴上皮細胞增殖和凋亡之間的相對平衡,因此胃黏膜細胞凋亡與增殖的變化,也是 AGM L發(fā)生的重要機制之一。業(yè)已證實,正常胃黏膜細胞存在凋亡,是一種順序性的細胞主動死亡過程,它與細胞增殖一起共同調(diào)節(jié)胃黏膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)態(tài)。有研究報道:在 AGML應(yīng)激期,不但伴隨著胃黏膜細胞凋亡的明顯增加,而且伴隨著增殖能力的下降,他們之間的失衡是潰瘍發(fā)生的重要原因[6]。細胞凋亡和增殖嚴格受基因調(diào)控,目前研究較多的有 Bcl-2/Bax細胞凋亡基因家族和增殖細胞核抗原(PCN A),后者與細胞 DNA合成關(guān)系密切 ,在細胞增殖的啟動上起重要作用,可標記 S期、G期及 M期的增殖細胞,是反映胃黏膜增殖功能的可靠指標。目前西醫(yī)預(yù)防 AGML的藥物治療,多偏重于降低攻擊因子方面,如 H2受體拮抗劑,質(zhì)子泵抑制劑等。因此,尋找多途徑、多靶點的作用藥物,包括對胃粘膜細胞凋亡與增殖平衡作用的藥物研究,可為防治 AGM L研究拓展思路。

AGM L屬中醫(yī)“胃脘痛”、“吐血”、“便血”等范疇 ,中醫(yī)辨證多以胃熱壅盛和瘀血阻絡(luò)為主,故論治時應(yīng)以清熱化瘀為主,輔以理氣和胃。大量臨床資料和實驗研究[7-8]也證明:中藥治療具有保護胃粘膜,促進其修復(fù)和愈合的作用。護胃方由生大黃、三七、龍膽草、吳茱萸等藥物組成,長期臨床應(yīng)用觀察顯示,該方可有效減輕患者的癥狀,提高臨床痊愈率。本實驗結(jié)果顯示,預(yù)防性使用該方可明顯減輕吲哚美辛致 AGML模型大鼠的胃粘膜損傷程度、降低炎癥積分,使胃粘膜組織中的 Bcl-2蛋白表達增強和 Bax蛋白表達下降及減少胃粘膜細胞凋亡,同時使 PCN A的表達增強。說明護胃方具有預(yù)防 NSAIDs致AGM L作用,其可能機制為抑制細胞凋亡和促進細胞增殖;中藥復(fù)方同時具有多途徑、多靶點效應(yīng),在有效預(yù)防 AM GL方面較單純抑制胃酸藥存在綜合作用的更多優(yōu)勢,值得進一步深入研究。

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