洪 城, 王 健, 李 冰, 彭公永, 胡錦興, 冉丕鑫△

(廣州醫(yī)學(xué)院1第一附屬醫(yī)院,廣州呼吸疾病研究所,呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 廣州 510120)

分次膠原酶消化法分離、培養(yǎng)成人肺微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞＊

洪 城1, 王 健1, 李 冰2, 彭公永1, 胡錦興1, 冉丕鑫1△

(廣州醫(yī)學(xué)院1第一附屬醫(yī)院,廣州呼吸疾病研究所,呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 廣州 510120)

目的:建立一種簡(jiǎn)便、高效分離和培養(yǎng)成人肺微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法并鑒定該方法培養(yǎng)的傳代細(xì)胞生物學(xué)特性。方法:分次膠原酶消化法與傳統(tǒng)膠原酶消化法進(jìn)行細(xì)胞獲得率、細(xì)胞存活率及培養(yǎng)成功率比較;繪制生長(zhǎng)曲線對(duì)原代與傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)特性進(jìn)行分析;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、平滑肌肌動(dòng)蛋白 (S Mα-actin)測(cè)定及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定及純度計(jì)算;比較原代與第 10代細(xì)胞形態(tài)、S Mα-actin含量、染色體數(shù)量及形態(tài)。結(jié)果:分次膠原酶消化法優(yōu)于傳統(tǒng)膠原酶消化法,細(xì)胞獲得率 (3.10±0.29vs1.20±0.35)×108cells/L、細(xì)胞存活率(69%vs21%)及培養(yǎng)成功率 (61.5%vs16.7%)(P<0.01);傳代細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)間 7 d快于原代細(xì)胞 21 d;細(xì)胞顯典型的“峰 -谷”狀生長(zhǎng),胞漿內(nèi)表達(dá) S Mα-actin,細(xì)胞純度達(dá) 98%以上;原代與第 10代細(xì)胞形態(tài)、S Mαactin含量、二倍體數(shù)量 (78.13%vs76.47%)及形態(tài)無(wú)明顯差別 (P>0.05)。結(jié)論:分次膠原酶消化法是一種簡(jiǎn)便、可行,獲得高純度、功能良好的成人肺微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法。經(jīng)過(guò)此方法分離、培養(yǎng)的細(xì)胞在 10代以?xún)?nèi)傳代培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)特性穩(wěn)定,可用于實(shí)驗(yàn)。

成人肺微小動(dòng)脈;平滑肌細(xì)胞;分次膠原酶消化法;傳統(tǒng)膠原酶消化法

Adult distal pulmonary artery;Smooth muscle cells;Step-by-step collagenase digestion;Traditional collagenase digestion

肺微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 (pulmonary distal artery smooth muscle cells,PDAS MCs)是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞成份,也是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞,體外培養(yǎng)的 PDAS MCs是研究血管壁細(xì)胞生物學(xué)行為及肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程的重要材料。然而影響 PDAS MCs體外培養(yǎng)的因素很多,尤其是成人肺微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(adult pulmonary distal artery smooth muscle cells,APDAS MCs)體外培養(yǎng)難度很大[1,2]。因此,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室選用動(dòng)物肺組織作為 PDAS MCs體外培養(yǎng)材料[3],也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室選用人類(lèi)引產(chǎn)胎兒動(dòng)脈主干為材料[1]。雖然動(dòng)物細(xì)胞在體外比較容易培養(yǎng),但其生物學(xué)特性與人類(lèi)細(xì)胞存在不少差異,據(jù)此得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能準(zhǔn)確反映人體的實(shí)際情況。另外,肺動(dòng)脈主干并非肺動(dòng)脈高壓主要病理改變部位而且引產(chǎn)胎兒標(biāo)本不易獲得,方法難以推廣。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找一種以成人肺組織為材料,簡(jiǎn)便、高效的 APDAS MCs分離、培養(yǎng)方法,以建立穩(wěn)定的 APDAS MCs體外培養(yǎng)模型,為開(kāi)展相關(guān)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 選取≤55歲,肺部手術(shù)患者切除的正常外周肺組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 低糖 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (fetal

bovine serum,FBS)購(gòu)自 Gibco,I型膠原酶、木瓜蛋白酶購(gòu)自Sigma,小鼠抗人 S Mα-actin單抗購(gòu)自 R&D,山羊抗小鼠 IgG-FITC(fluorescein isothiocyanate,FITC)、4′,6-二脒 -2-苯基吲哚 (4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、1,4-二硫代蘇糖醇 (1,4-dithiothreitol,DTT)、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)購(gòu)自普博欣生物公司。透射電鏡 (100CX-Ⅱ)、體式顯微鏡 (Nikon S MZ1000)、激光掃描共聚焦顯微鏡 (Nikon TE2000-E)、倒置相差熒光顯微鏡 (Leica)。

1.3 消化酶及平衡液等試劑配制 見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

2 方法

2.1 肺動(dòng)脈平滑肌層分離 剪取手術(shù)切除肺組織外周正常部分,置于 4℃平衡鹽溶液 (Hanks balanced salt solution,HBSS)配方見(jiàn)文獻(xiàn)[4],盡快送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。清洗去血漬,體式顯微鏡下用顯微器械分離出肺微小動(dòng)脈。仔細(xì)剝除動(dòng)脈外膜 (纖維脂肪層),后將血管條縱向剪開(kāi),內(nèi)面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜。將動(dòng)脈中膜 (平滑肌層)剪成小塊約 2 mm×3 mm×1 mm,平均分成 2組分別采用分次膠原酶消化法 (step-by-step collagenase digestion,SCD)及傳統(tǒng)膠原酶消化法 (traditional collagenase digestion,TCD)進(jìn)行PDAS MCs分離、培養(yǎng)。

2.2 2組細(xì)胞獲得數(shù)和存活率比較 分別采用 SCD及 TCD進(jìn)行細(xì)胞分離。SCD簡(jiǎn)述如下:將中膜組織放入 4℃HBSS中 30 min后,更換無(wú)含鈣的 HBSS室溫放置 20 min。將組織塊放入消化液中,37℃消化 35-45 min,輕輕吸出消化液,加入培養(yǎng)基室溫放置 3 min,吹打,可見(jiàn)絮狀物。靜置片刻待組織塊沉淀于離心管底部,吸出細(xì)胞懸液收集于離心管中。原消化液加回組織塊中繼續(xù)消化 5 min,按上述步驟收集細(xì)胞,再重復(fù)消化、收集細(xì)胞 2次。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活率、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),每個(gè)樣本進(jìn)行 3次實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)均采用復(fù)孔。TCD如下:中膜組織處理同 SCD,處理后放入消化液中37℃消化 90 min,加入培養(yǎng)基吹打,收集細(xì)胞懸液 (余操作同前)。獲得的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),比較 2種消化法分離的細(xì)胞培養(yǎng)成功率。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制 細(xì)胞計(jì)數(shù)后,加入培養(yǎng)基于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),3 d更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層融合后即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)可傳代培養(yǎng)。選擇較好消化法分離的細(xì)胞進(jìn)行原代及第 10代細(xì)胞培養(yǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線,細(xì)胞懸液中加入培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,種植于 24孔板中,每天于同一時(shí)點(diǎn)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制生長(zhǎng)曲線。

2.4 細(xì)胞鑒定、純度計(jì)算 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)及排列方式并拍照。采用 FITC/DAPI雙標(biāo)記免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞 S Mα-actin表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定及純度計(jì)算,操作方法見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。透射電鏡觀察細(xì)胞肌絲等超微結(jié)構(gòu),電鏡玻片制作方法參考文獻(xiàn)[2]。

2.5 不同代數(shù)細(xì)胞生物學(xué)特性比較 比較原代與第 10代細(xì)胞生物學(xué)特性,顯微鏡觀察 2組細(xì)胞不同生長(zhǎng)時(shí)期形態(tài)并拍照;細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法標(biāo)記 2組細(xì)胞 S Mα-actin,JD801圖像分析系統(tǒng)檢測(cè) 2組細(xì)胞熒光積分吸光度 (integral absorbance, IA),IA間接反映細(xì)胞肌絲含量;透射電鏡觀察 2組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并進(jìn)行比較;常規(guī)氣干法制備細(xì)胞染色體玻片,吉姆薩染色,比較 2組細(xì)胞染色體數(shù)量、形態(tài)及計(jì)算染色體倍數(shù)。每組觀察 3張染色體玻片,每張玻片隨機(jī)選取 5個(gè)不重疊視野,計(jì)算分裂相中二倍體、四倍體、非整倍體各占分裂相細(xì)胞總數(shù)的百分比。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 2組細(xì)胞獲得數(shù)和存活率比較

消化后收集細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),SCD獲得細(xì)胞數(shù)為(3.10±0.29)×108cells/L(n=6),細(xì)胞存活率 69%。TCD為 (1.20±0.35)×108cells/L(n=6),細(xì)胞存活率 21%,2種方法差異顯著 (均 P<0.01)。共選 25例標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),其中13例采用 SCD、12例采用 TCD進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),2組供體平均年齡、患病種類(lèi)差異無(wú)顯著 (P>0.05),見(jiàn)表 1。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示,SCD培養(yǎng) 8例成功,TCD培養(yǎng) 2例成功。成功率分別為 61.5%、16.7%,2組培養(yǎng)成功率差異顯著 (P<0.01)。2組肺癌患者所占比例基本一致,見(jiàn)表 1,SCD成功培養(yǎng) 4例肺癌患者細(xì)胞,成功率為 51.7%,TCD未培養(yǎng)出肺癌患者細(xì)胞,2組肺癌患者細(xì)胞培養(yǎng)成功率差異顯著 (P<0.01)。

表 1 2種消化法培養(yǎng) APDASMCs結(jié)果及 2組標(biāo)本供體情況Table 1. Comparison between traditional collagenase digestion(TCD)and step-by-step collagenase digestion(SCD)forobtainingAPDAS MCs and the station of donor

2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及生長(zhǎng)曲線繪制

倒置相差顯微鏡下觀察,原代細(xì)胞剛種植時(shí)呈圓形、透亮、單個(gè)均勻分布。7 d后細(xì)胞大部分貼壁、展開(kāi),14 d細(xì)胞數(shù)量較前增多。細(xì)胞數(shù)量少時(shí),呈長(zhǎng)梭形、多角,見(jiàn)圖 1A。24d細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí),呈束狀排列,部分區(qū)域細(xì)胞多層重疊、部分區(qū)域顯單層,高低起伏形成平滑肌細(xì)胞特征性的“峰 -谷”狀生長(zhǎng),見(jiàn)圖 1B。傳代細(xì)胞形態(tài)與原代基本一致,但生長(zhǎng)速度明顯快于原代細(xì)胞。傳代第 1 d大部分細(xì)胞已貼壁、展開(kāi),3 d細(xì)胞數(shù)量明顯增多,7 d細(xì)胞長(zhǎng)至融合形成典型的“峰 -谷”狀生長(zhǎng),原代與第 10代 PDAS MCs生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖 2。

Figure 1.Morphology of pr imary cultured APDAS MCs by phase-contrast microscopy at 14 d(A)and 24 d(B)(×100).圖 1 不同培養(yǎng)天數(shù)原代 APDASMCs生長(zhǎng)情況

Figure 2.Cell growth cure in the pr imary and the tenth passage.圖 2 不同代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 細(xì)胞鑒定、純度計(jì)算

共聚焦顯微鏡下觀察 2種消化法培養(yǎng)細(xì)胞的 S Mα-actin表達(dá)均顯陽(yáng)性。鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型,胞核橢圓型發(fā)紅色熒光,胞漿內(nèi)可見(jiàn)發(fā)綠色熒光的 S Mα-actin。陰性對(duì)照僅見(jiàn)發(fā)紅色熒光的細(xì)胞核,圖 3A、B。高倍鏡下見(jiàn)胞漿內(nèi)發(fā)綠色熒光的平滑肌肌絲,肌絲與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行、絲狀、束狀排列。透射電鏡觀察,胞漿內(nèi)富含肌絲,肌絲束之間可見(jiàn)密體、密斑等平滑肌細(xì)胞特有結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖 4A、B。通過(guò)計(jì)算平滑肌細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率得出平滑肌細(xì)胞純度,經(jīng)過(guò)計(jì)算細(xì)胞純度達(dá) 98%以上。

4 原代與第 10代 APDASMCs生物學(xué)特性比較

4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),原代與第 10代 APDAS MCs形態(tài)基本相似。

Figure 3.Determination of S Mα-actin by double fluorescence image ofAPDAS MCs(A)and control(B)(×200).圖 3 雙熒光免疫細(xì)胞染色檢測(cè) APDAS MCs表達(dá) S Mα-act in

Figure 4.Bundles of actin microfilaments in APDAS MCs.A:immunofluorescence microscopy,using antibodies to S Mα-actin(×600);B:scanning electron microscope(×28 000).↑ denotes actin microfilaments;△denotes dense body and? denotes dense patch.圖 4 免疫熒光細(xì)胞染色檢測(cè) APDASMCs肌絲(A),掃描電鏡檢測(cè) APDASMCs肌絲、密體和密斑的超微結(jié)構(gòu)(B)

4.2 細(xì)胞 S Mα-actin含量測(cè)定 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色后,原代與第 10代細(xì)胞胞漿均發(fā)綠色熒光,2組熒光亮度無(wú)明顯區(qū)別,見(jiàn)圖 5A、B。JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)顯示 2組IA值差別無(wú)顯著 (P>0.05),見(jiàn)表 2。

表 2 不同代數(shù) APDASMCsα-actin免疫熒光化學(xué)染色后測(cè)定 IA值Table 2. IAofα-actin immuno-fluorescence staining of the primary culture and the tenth passage of APDAS MCs(n=6)

表 2 不同代數(shù) APDASMCsα-actin免疫熒光化學(xué)染色后測(cè)定 IA值Table 2. IAofα-actin immuno-fluorescence staining of the primary culture and the tenth passage of APDAS MCs(n=6)

Group IA The primary cells 144.34±36.89 The tenth passage cells 138.46±43.94

4.3 透射電鏡觀察 2組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 2組細(xì)胞胞核大小基本一致,傳代后未見(jiàn)細(xì)胞核增大,2組細(xì)胞胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及含量未見(jiàn)明顯差別,傳代后未見(jiàn)線粒體腫脹、空泡化及固縮等現(xiàn)象,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)明顯擴(kuò)張,胞漿內(nèi)未見(jiàn)髓鞘樣結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖 6A、B。

Figure 5.Expression of S Mα-action in the primary(A)and the tenth passage APDAS MCs(B)(×200).圖 5 原代與第 10代 APDASMCs表達(dá) SMα-action

Figure 6.Ultra-microstructure in the pr imary(A)and the tenth passage APDAS MCs(B).Arrows↑denote endocytoplasmic reticulum(A)and chondriosome(B).圖 6 原代與第 10代 APDASMCs的超微結(jié)構(gòu)

4.4 細(xì)胞染色體倍數(shù)計(jì)算 2組分裂相細(xì)胞總數(shù)基本一致。原代細(xì)胞二倍體占分裂相細(xì)胞總數(shù) 78.1%、第 10代細(xì)胞二倍體占分裂相細(xì)胞總數(shù) 76.5%,2組差別無(wú)顯著 (P>0.05)。

2組細(xì)胞二倍體、四倍體及非整倍體占分裂相細(xì)胞總數(shù)的百分比差別無(wú)顯著 (P>0.05),未見(jiàn)明顯畸形染色體,見(jiàn)圖 7、表 3。

Figure 7.Amount and morphous ofAPDAS MCs chromatin in the primary(containing 46)(A)and the tenth passage(containing 46)(B)(×1 000).圖 7 原代與第 10代 APDASMCs染色體數(shù)量及形態(tài)

表 3 不同代數(shù)細(xì)胞染色體核型比較Table 3.Karyotyping of the pr imary and the tenth passage ofAPDAS MCs

討 論

國(guó)內(nèi)外多采用酶消化法分離 PDAS MCs[1,3-5]。由于肺微小動(dòng)脈管徑小、管壁薄,并且外膜與中膜間黏連緊密,無(wú)顯微設(shè)備條件下很難干凈剝離出肺微小動(dòng)脈平滑肌層,而且平滑肌組織結(jié)構(gòu)致密,因此傳統(tǒng)方法需要較長(zhǎng)的消化時(shí)間[1,5]。導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于消化酶中,細(xì)胞活力、存活率下降并可能引起細(xì)胞生理以及性狀的改變。為了解決以上問(wèn)題,我們對(duì)傳統(tǒng)酶消化法進(jìn)行改良[4]。使用顯微設(shè)備干凈剝離出平滑肌層提高了細(xì)胞純度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用顯微設(shè)備使細(xì)胞純度達(dá) 98%以上。

供體年齡是原代細(xì)胞培養(yǎng)成敗的重要影響因素,預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用 SCD和 TCD酶消化法對(duì)大鼠 PDAS MCs進(jìn)行原代培養(yǎng),2種方法培養(yǎng)成功率無(wú)明顯差別。因?yàn)榇笫篌w細(xì)胞活力、增殖力強(qiáng)于成人,雖然消化酶對(duì)大鼠細(xì)胞也有損傷,但種植后細(xì)胞能夠在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)并迅速增殖,所以 2種方法的培養(yǎng)成功率無(wú)明顯差異。而成人情況卻不同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用 TCD分離的成人體細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)成功率明顯低于 SCD。肺癌患者進(jìn)行肺葉切除的機(jī)會(huì)大,本實(shí)驗(yàn)獲取 25例標(biāo)本中肺癌患者標(biāo)本占 52%。由于多數(shù)肺癌患者年齡大,使用 SCD縮短了細(xì)胞在消化酶中浸泡時(shí)間,減少了消化過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損傷、同時(shí)組織深層的細(xì)胞不斷暴露于消化酶中進(jìn)行消化,獲得的細(xì)胞數(shù)量增加。結(jié)果顯示采用 SCD法成功培養(yǎng)出 4例肺癌患者 PDAS MCs,成功率 57.1%,而 TCD法未能培養(yǎng)出肺癌患者的 PDAS MCs。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的 APDAS MCs生長(zhǎng)速度緩慢,同時(shí)合格的人類(lèi)肺組織標(biāo)本不易獲得,所以原代培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量往往不能滿足實(shí)驗(yàn)要求,需要傳代培養(yǎng)?？紤]到供體年齡大、體質(zhì)差,其體細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代后可能發(fā)生變化。為了保證研究的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)幾個(gè)不同層面的研究對(duì)原代與傳代細(xì)胞進(jìn)行比較,檢測(cè)傳代后細(xì)胞是否發(fā)生變異。一般傳 4-5代細(xì)胞數(shù)量能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求,因此選擇原代與傳至第 10代細(xì)胞進(jìn)行比較。首先對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)2組細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式基本一致。平滑肌細(xì)胞 S Mαactin含量變化作為判斷平滑肌細(xì)胞表型變化的主要依據(jù)[6],2組細(xì)胞 S Mα-actin含量基本一致,說(shuō)明傳代后細(xì)胞表型未發(fā)生明顯變化。透射電鏡對(duì) 2組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較未發(fā)現(xiàn) 2組細(xì)胞各種細(xì)胞器存在明顯差異。檢測(cè) 2組細(xì)胞染色體倍數(shù)發(fā)現(xiàn) 2組細(xì)胞二倍體細(xì)胞占分裂相細(xì)胞總數(shù)的百分率無(wú)明顯差異,說(shuō)明細(xì)胞在傳代過(guò)程中染色體遺傳穩(wěn)定。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)可以認(rèn)為,SCD是一種能夠以較大年齡患者包括肺癌患者的肺組織為標(biāo)本的簡(jiǎn)便、可行,并且獲得高純度、功能良好的APDAS MCs的方法。經(jīng)過(guò)此方法培養(yǎng)的細(xì)胞在10代以?xún)?nèi)傳代培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)、表型及遺傳學(xué)穩(wěn)定,可用于實(shí)驗(yàn)。

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R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2010.06.040

1000-4718(2010)06-1240-04

2009-11-09

2010-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.30770953)

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