田玉旺 李 琳 朱紅艷 邢 宜 苗金紅

(北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科,北京100700)

提高冷凍切片制片質(zhì)量的方法探討

田玉旺 李 琳 朱紅艷 邢 宜 苗金紅

(北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科,北京100700)

冷凍切片;質(zhì)量;探討

術(shù)中冷凍切片診斷是病理科的急診工作,其重要性和責(zé)任性都很大。其中冷凍切片質(zhì)量的好壞至關(guān)重要,它是許多病理技術(shù)人員一直探討的問題。本文對影響制片質(zhì)量的各種因素及環(huán)節(jié)進行了分析,并提出了可行的防范措施,使制片質(zhì)量明顯提高。

材料和方法

1.標本選取我院手術(shù)中的各種活體組織標本。

2.儀器德國徠佧-1900型冷凍切片機。

3.方法冷凍切片方法和染色方法基本同常規(guī),切片厚5μm。

結(jié)果和討論

在整個制片過程中注意文中所述細節(jié)后,制片質(zhì)量明顯提高,組織結(jié)構(gòu)清晰,核漿染色鮮艷,組織內(nèi)冰晶明顯減少。

影響冷凍制片質(zhì)量的因素較多,我們經(jīng)大量實驗及實際應(yīng)用,認為在整個制片過程中應(yīng)注意以下細節(jié)。

1.做好前期準備工作

1.1 日常工作中,儀器要定期進行擦拭、除霜、清潔消毒等,使冷凍切片機始終處于良好的運行狀態(tài)。

1.2 切片刀要定期進行更換,調(diào)整好切片刀的角度,刀頭刀架不要松動,不同的組織可使用不同刀片,一般組織選用R-35型,較硬的組織,如宮頸組織、子宮肌瘤等,使用A-35型較好。防卷板調(diào)整到最佳位置,防卷板要注意清潔,避免切片污染和切片出現(xiàn)皺褶。在切片過程中,盡量不要隨意調(diào)整切片刀的角度和防卷板的位置,以免延長制片時間。

1.3 試劑及染液要定期進行更換,以保證染色質(zhì)量。

2.取材方面

標本取材大小要合適,因為組織冷凍速度的快慢,依賴于溫度、組織的大小及厚薄,取材大小一般為1.5×1.5×0.3cm為宜。取材時,盡量避開組織壞死出血區(qū),要盡量剔除脂肪、毛發(fā)、骨及鈣化物;取材時注意干燥,取材工具盡量不要接觸水,囊性組織內(nèi)有很多液體,取材時不要用水沖洗;若組織標本表面附著大量粘液或血液需用紙巾擦拭干凈,不能用水沖洗。取材用的刀剪應(yīng)當鋒利,取材時避免刀來回挫動擠壓組織。

另外,術(shù)中組織送檢要及時,以保證標本新鮮。冷凍切片標本不要浸入酒精、生理鹽水和甲醛液內(nèi);需要術(shù)中進行快速病理診斷的活檢組織,最好用一次性塑料或乳膠手套盛放,切忌用干紗布、衛(wèi)生紙或干棉花包裹組織,以免紗布等上面的線毛粘在組織上,不利于制片,且易損傷刀刃。

3.冷凍條件的設(shè)置

冷凍切片是借助在低溫的條件下,使組織迅速凍結(jié)達到一定硬度進行切片的一種方法。一般工作時間內(nèi),箱體的溫度設(shè)在-20℃左右,非工作時間設(shè)在-15℃左右較好。由于各種組織的結(jié)構(gòu)不同,適宜的切片條件也有所不同?？刂坪美鋬鼋M織的溫度和冷凍時間是制作優(yōu)質(zhì)切片的關(guān)鍵。

3.1 肝臟、脾、腦、腎臟、甲狀腺組織、淋巴結(jié)等細胞較豐富,纖維組織較少的標本,冷凍室溫度一般控制在-16℃～-18℃左右,冷凍時間應(yīng)當縮短,否則組織變脆、易碎,鏡下形成裂隙,破壞了組織結(jié)構(gòu),影響診斷。冷凍時間控制在1min左右,且適當切薄。

3.2 對于質(zhì)韌、硬的宮頸組織、子宮肌瘤等纖維多的組織,冷凍室溫度一般為-19℃～-22℃之間,冷凍時間也不宜過長,控制在2min左右較好,過長會使組織變硬,不僅損刀而且組織片會出現(xiàn)裂痕、厚薄不均或呈簾狀,染色時易脫片。切片時,速度可相對慢一些。

3.3 含脂肪的乳腺組織,冷凍室的溫度一般控制在-25℃～-30℃左右;脂肪瘤等多脂肪的組織冷凍室的溫度在-35℃以下,冷凍時間要適當延長,一般5min左右。脂肪含量多的組織標本,由于脂肪組織冰點低,只有低于-40℃才能凍硬,單壓縮機的冷凍切片機達不到其冷凍溫度,因此不易制片。雙壓縮機的冷凍切片機機頭溫度可在2-3min內(nèi)降到-50℃,把冷凍托夾在機頭的樣本夾上,待脂肪組織凍硬后即可切出完整切片。另一種方法是:將脂肪組織放入液氮速凍后,利于切片。切片時進刀要快,否則切片粘連。

3.4 卵巢、肺、膽囊、胃壁、腸壁、胰腺等軟組織,冷凍室的溫度控制在-20℃～-22℃左右,冷凍時間2min。

3.5 睪丸、膀胱組織,冷凍室溫度-18℃～-20℃,冷凍時間2min左右。

3.6 皮膚組織、肌肉組織,冷凍室溫度一般控制在-22℃～-25℃,冷凍時間3min左右。

3.7 實驗動物標本的冷凍溫度和冷凍時間,在制片過程中均需相應(yīng)的縮短。

4.包埋方面

囊壁、包膜等組織因較薄,冰凍切片時容易卷曲、折疊,可將這些組織切成長條狀,然后把它卷曲成團,立著放在預(yù)冷好的冷凍托上,然后組織四周放適量包埋劑,使組織呈站立狀態(tài),以利于組織全層切片完整。

對破碎、較小的組織標本,如腎穿組織,采用先將少許包埋劑放在冷凍托上,待包埋劑凍凝后,用冷凍切片機修出包埋劑平面,然后取下冰托,將組織放在包埋劑平面上,再加少許包埋劑,冷凍后按原來的位置放在冷凍切片機上進行常規(guī)切片。本法在放組織前先將包埋劑的切面修好,形成細切狀態(tài),這樣放上組織后就可直接對其進行修切,利于切片刀與組織的角度保持一致,易于切出組織最大面,防止把組織修切掉,避免了因組織過小而放棄制片或制片不理想的弊端。

5.切片方面

切片厚度一般為5μm,脂肪組織可稍厚些,淋巴組織3-4μm。切片時用力要均勻,先將組織輕修后再觀察切面,看有無包膜、結(jié)節(jié)、鈣化等,深修到組織最大切面。有包膜的一定要切完整,小的結(jié)節(jié)或重點病變部位要切到,避免漏診、誤診。軟硬不同的組織,質(zhì)地較硬的部分應(yīng)放在上面,如皮膚,將表皮面放在標本的上端,先切較軟的皮下組織,依次切真皮、表皮。胃腸組織切片時應(yīng)橫向放置,粘膜面向下,漿膜面向上。

另外,要掌握好切片的最佳時機,一般情況下,將組織樣品托放在速凍臺上速凍,組織塊從邊緣開始冷凍變白,當變白區(qū)域逐漸向中央縮小,及時使用冰錘助凍,組織塊立即全部變白瞬間,此時為最佳切片時機。

對于活檢小組織冷凍時間相對短一些,以肉眼觀察周圍全發(fā)白時及時修整,避免組織過脆,切片時速度可相對慢且要勻速切片,過快會出現(xiàn)跳刀現(xiàn)象。

特殊組織如淋巴結(jié),觀察組織上部有一小點未完全凍凝時快速進行切片。

質(zhì)地較硬的組織,如子宮肌瘤、宮頸組織等,以肉眼待冷凍組織中央反光區(qū)尚存光澤時為最佳切片時機。由于宮頸組織結(jié)構(gòu)較致密,對冷凍的時間及溫度較敏感,組織易冷凍過度,組織切片易出現(xiàn)搓板狀或梯田狀厚薄不均現(xiàn)象,因此必須注意觀察,發(fā)現(xiàn)組織與冷凍托接觸的面凍硬,且組織表面尚有少許光澤時即開始修塊。如果冷凍過硬,可以用手貼在組織面上,使組織回溫再切片。切片時將肌組織上下對角放置,可減少切片的阻力,易切成平整的薄片。

切片切好后用載玻片或蓋玻片貼片時手不能顫抖,而且在貼附組織時手要有一個向下伸展的動作,以防組織貼附不平或有皺褶。壞死組織等在染色過程中有時容易脫片,解決辦法:首先切片不能太厚,切片后,先用酒精燈稍烤一下或用吹風(fēng)機稍吹干,固定后行染色。

6.固定問題

組織固定是保證制片質(zhì)量的關(guān)鍵,組織切片后立即固定能有效抑制或破壞組織細胞內(nèi)各種酶的活性,沉淀蛋白質(zhì),防止組織自溶和腐敗,保證組織細胞與正常生活時形態(tài)相似。經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰,便于辨認。冷凍切片若固定不佳,細胞易變形,細胞核變大,胞漿邊界不清,細胞核著色力下降,染色結(jié)構(gòu)模糊不清,影響診斷,所以切片后固定要及時、充分,不要在空氣中停留時間過長,不提倡電吹風(fēng)吹干后固定,否則細胞容易發(fā)生退變及細胞收縮。同時,固定液選擇要得當,我們比較了甲醇、95%酒精、10%福爾馬林、AAF液、丙酮、混合固定液(無水酒精45ml,甲醇45ml,冰醋酸10ml)六種固定液,我們認為混合固定液固定2min效果較好,組織結(jié)構(gòu)清晰,細胞收縮小,核漿對比鮮明。固定后水洗要充分,以便將包埋劑洗干凈,否則,切片背景不干凈,影響觀察。

7.染色方面

因新鮮組織對染液的親和力較強,蘇木素染30s-1min即可。為了縮短制片時間,可以使用加溫的蘇木素(40-50℃)進行染色。若細胞染色過淺或模糊不清,應(yīng)適當延長固定時間和染色時間,當蘇木素染色能力下降時應(yīng)及時更換。分化要適當,分化過度核著色淺,分化不足細胞核的染色質(zhì)看不清楚。

8.避免冰晶產(chǎn)生的主要措施

在常規(guī)冷凍制片過程中,我們發(fā)現(xiàn)冷凍組織切片中常含有大量的冰晶存在,特別是在腦、肌肉等組織冷凍切片中更為多見(圖1)。冷凍組織切片內(nèi)冰晶的消除問題,是大家試圖解決的一個難點問題。由于冰晶的產(chǎn)生,使組織細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變,致使臨床病理診斷受到嚴重影響。

我們知道,水在-4℃時體積最大,這就意味著組織在-4℃左右的低溫環(huán)境中停留時間越長,組織內(nèi)所產(chǎn)生的冰晶的體積越大,數(shù)量越多,即組織內(nèi)形成冰晶的數(shù)量與組織冷凍的速度成反比,因此,要盡量避免緩慢的冷卻,使組織的溫度迅速降到-4℃以下,可減少冰晶的形成。

我們經(jīng)大量實驗,認為日常工作中注意以下幾點,可有效地避免組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生(圖2):

8.1 在不影響病理診斷的前提下,標本取材盡量小一些,組織厚度勿超過3mm,這樣有利于組織的快速凍結(jié),否則,組織過大,冷凍時間過長,組織內(nèi)容易產(chǎn)生冰晶。

圖1 傳統(tǒng)方法,腦組織內(nèi)冰晶較多。冷凍切片×100Fig.1 Traditional method.The ice crystal of brain tissue is much more.Frozen section×100

8.2 臨床科若術(shù)中需要冰凍,應(yīng)通知病理科,以便提前開機做好準備,這樣可避免由于緩慢冷凍所產(chǎn)生的冰晶。因為冷卻速度越快,過冷溫度越低,所形成的晶核數(shù)量越多,晶體來不及生長就被凍結(jié),從而失去了形成較大冰晶的機會。

8.3 標本托上的OCT等包埋劑不能放的過多,否則冷凍時間過長,也易產(chǎn)生冰晶。

8.4 送檢的標本不要用生理鹽水、酒精浸泡或用濕紗布包裹組織,由于液體浸泡后,組織內(nèi)水分會增加,組織上的污物不能用水沖洗,否則,易造成冷凍后組織內(nèi)冰晶形成增多。

圖2 改良法,腦組織內(nèi)冰晶明顯減少,冷凍切片×200Fig.2 Modified method.The ice crystal of brain tissue is remarkablely reduced.Frozen section×200

8.5 低溫驟冷組織:冷凍開始時,冰晶形成速率較慢,以后逐漸增加,其臨界溫度為-33℃,從-30℃降到-43℃之間,成核率急劇增加達10倍左右,然后再減慢。因此,縮短組織從-30℃降到-43℃的時間,可以大大減少冰晶的形成。在常規(guī)冷凍組織制片中,冷凍組織一般需要幾分鐘,從而常形成很多冰晶。根據(jù)上述理論,用-196℃液氮使組織快速冷凍,液氮能在幾秒鐘內(nèi)將組織降到-196℃的超低溫,最大限度地減少了冰晶的形成,對容易形成冰晶的肌肉、腦等組織采用液氮速凍,可減少冰晶的形成。含脂肪較多的組織采用此法亦較易制片。

8.6 有的單位使用普通膠水作為包埋劑,但需注意膠水不能太稀,尤其是制作小組織的切片時更要注意,以免膠水中過多的水分滲入組織中形成冰晶,造成細胞腫脹,影響診斷。

8.7 送檢組織不要用水沖洗,以防人為因素帶入水分;若組織本身水分較多,冷凍前可用濾紙或紙巾輕壓吸干組織上的水分,以減少冰晶的形成。

8.8 巧用冷凍頭的溫度設(shè)置功能,一開始將冷凍切片機冷凍頭溫度設(shè)置的低一些,這樣也可縮短組織的冷凍時間,減少冰晶形成機會。待組織凍好后,根據(jù)不同組織,再調(diào)到適宜溫度。

另外,技術(shù)人員在整個制片過程中,要保持良好的心態(tài),切勿急躁,接到標本后對組織的質(zhì)地等要進行識別與判斷,要根據(jù)組織的性質(zhì)調(diào)整制片細節(jié)及注意事項。

R361.2

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.021

2009-12-20

2010-03-10

田玉旺,男(1962年),漢族,主任技師。