郭華雄鄧明鳳陳登峰張柳袁 璐劉 靜楊 勇徐正豐王昌富＊

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院1病理科,2中心實(shí)驗(yàn)室,3乳腺科 荊州434020)

FISH和IHC檢測HER2基因及蛋白在乳腺癌診治中的應(yīng)用

郭華雄1鄧明鳳2陳登峰3張柳1袁 璐1劉 靜1楊 勇1徐正豐3王昌富2＊

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院1病理科,2中心實(shí)驗(yàn)室,3乳腺科 荊州434020)

目的 對比研究免疫組織化學(xué)(IHC)與熒光原位雜交(FISH)方法檢測乳腺癌中C-erbB-2蛋白表達(dá)和HER2基因擴(kuò)增,評估兩種方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。方法 IHC和FISH法分別檢測58例乳腺癌組織中C-erbB-2蛋白表達(dá)和HER2基因擴(kuò)增狀況,并進(jìn)行一致性分析。結(jié)果 IHC檢測蛋白陽性2+和3+共22例,占總病例的37.9%,58例乳腺癌中FISH檢測出HER2基因擴(kuò)增17例,占29.3%。IHC檢測C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因擴(kuò)增陽性,1例無擴(kuò)增;C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可見HER2基因擴(kuò)增;C-erbB-2蛋白1+者11例HER2基因擴(kuò)增僅1例。C-erbB-2蛋白陰性病例共25例均未檢測到基因擴(kuò)增。結(jié)果顯示IHC檢測C-erbB-2蛋白與FISH檢測 HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)有較高的一致性(k=0.681,P<0.01),C-erbB-2蛋白陰性和3+標(biāo)本與HER2基因擴(kuò)增陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例與其 HER2基因擴(kuò)增差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 IHC檢測C-erbB-2蛋白強(qiáng)陽性(3+)和陰性(0)與 HER2基因擴(kuò)增有較高的一致性,可作為臨床是否應(yīng)用 Herceptin治療的依據(jù),而C-erbB-2蛋白2+和1+病例必須進(jìn)一步行HER2基因擴(kuò)增檢測。

乳腺癌;HER2基因;蛋白;熒光原位雜交;免疫組織化學(xué)

原癌基因 HER2的蛋白表達(dá)產(chǎn)物是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白(p185),屬表皮生長因子受體家族成員,通過細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和生長。目前研究表明,在乳腺癌中約有25%-30%的病例有HER2基因的擴(kuò)增和蛋白的過度表達(dá)[1,2],HER2陽性乳腺癌患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后不良,且常規(guī)化療效果不佳,而針對HER2陽性的分子靶向抗體赫賽汀(Herceptin)對乳腺癌有很好的療效,因此 HER2的檢測廣泛受到臨床和病理醫(yī)師的重視。目前常用的檢測方法有IHC和 FISH,但由于IHC檢測C-cerB-2陽性也并非代表的 HER2基因擴(kuò)增[3],我們應(yīng)用IHC和 FISH檢測乳腺癌中的 C-erbB-2蛋白及HER2基因表達(dá)狀況,分析二者之間一致性及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,為乳腺癌的診斷與治療提供可靠依據(jù)。

材料和方法

1.材料:

58例乳腺癌為本院病理科2008年1月-2008年9月的活檢和手術(shù)切除標(biāo)本,其中浸潤性導(dǎo)管癌54例,浸潤性小葉癌4例;所有病例均未行術(shù)前新輔助化療。

2.方法

2.1 制片:標(biāo)本離體后立即固定于10%的中性福爾馬林中,固定時(shí)間8-24h,常規(guī)脫水包埋,以4μm厚度連續(xù)切片3張分別用于 HE染色、IHC和FISH檢測。

2.2 免疫組織化學(xué)(IHC):C-erbB-2一抗為即用型單克隆抗體(Lab Vision產(chǎn)品),MaxVisionTM快速法試劑盒購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。常規(guī)切片、脫蠟入純水。組織切片放入p H6.0的檸檬酸緩沖液中,微波抗原修復(fù),用PBS(p H7.4)洗片后入3%甲醇 H2O210min,充分洗滌后加入一抗4℃冰箱過夜,PBS充分洗片,切片滴加即用型 MaxVisionTM試劑,室溫孵育15min,洗滌后加DAB顯色液后顯微鏡下觀察信號(hào)并終止顯色,蘇木素襯染,脫水、透明、封固。已知陽性切片作陽性對照,PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

2.3 熒光原位雜交(FISH):GLP HER2/ CSP17探針試劑盒(購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)。組織切片室溫下脫蠟,水化,酸性亞硫酸鈉50℃處理,蛋白酶 K37℃消化,HCl浸泡,-20℃梯度乙醇中脫水,室溫浸入丙酮固定,自然干燥玻片。55℃加熱玻片5-10min,變性液中浸泡5min,梯度脫水,將10μl變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域。封片后置于預(yù)熱的濕盒中,42℃保溫箱中過夜雜交16h。移去蓋玻片,立即將玻片分別置于50%甲酰胺/2×SSC、2×SSC 0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,70%乙醇浸泡3min后取出玻片,暗處自然干燥,將15μl DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置,覆以蓋玻片。暗處放置20min后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)。

2.4 結(jié)果判斷:

(1)IHC:參照美國臨床腫瘤協(xié)會(huì)/美國病理學(xué)家學(xué)院 HER2檢測指南評分系統(tǒng)[4]:浸潤性腫瘤細(xì)胞無著色為陰性(0),瘤細(xì)胞呈弱且不完整的胞膜著色或<10%瘤細(xì)胞呈較弱的胞膜染色為弱陽性(1+),≥10%瘤細(xì)胞有較弱但完整的胞膜著色或≤30%瘤細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的胞膜著色為陽性(2 +),>30%腫瘤細(xì)胞呈較強(qiáng)的完整細(xì)胞膜染色為強(qiáng)陽性(3+)。

(2)FISH:在10/40倍物鏡下觀察信號(hào),選擇細(xì)胞核大小一致、核的邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核孤立無重疊、綠色著絲粒信號(hào)清晰的區(qū)域,在100倍物鏡下,通過特異的單通道濾光片隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。正常細(xì)胞:單個(gè)間期細(xì)胞核中紅色及綠色信號(hào)各2個(gè)。HER2基因擴(kuò)增異常細(xì)胞:單個(gè)間期細(xì)胞核中紅色信號(hào)大于2個(gè)。Ratio值計(jì)算:Ratio值=30個(gè)細(xì)胞核中核中紅色信號(hào)總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠色信號(hào)總數(shù),Ratio<1.8提示該樣本無 HER2基因擴(kuò)增;Ratio>2.2提示樣本中 HER2基因擴(kuò)增,若兩種信號(hào)的比值>20或眾多信號(hào)連接成簇時(shí),可不用計(jì)算,即視為基因擴(kuò)增;Ratio在1.8-2.2之間時(shí),可以選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè),或者重新本次實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,FISH和ICH檢測方法采用kappa一致性檢驗(yàn)分析;HER基因擴(kuò)增與C-erbB-2蛋白表達(dá)陰/陽性率比較采用X2檢驗(yàn), P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.乳腺癌中HER2基因擴(kuò)增及蛋白表達(dá)

C-erbB-2蛋白陽性信號(hào)位于細(xì)胞膜,HER2基因擴(kuò)增為細(xì)胞核內(nèi)紅色信號(hào)大于2個(gè)(圖1-4)。58例乳腺癌中 FISH檢測出 HER2基因擴(kuò)增17例,占29.3%,IHC檢測 HER2蛋白有陽性信號(hào)者33例,占56.9%,其中陽性2+和3+共22例,占總病例的37.9%,C-erbB-2蛋白檢出率明顯高于HER2基因擴(kuò)增。

2.HER2基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)的相關(guān)性,見表1

本組IHC檢測C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因擴(kuò)增陽性,1例無擴(kuò)增,C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可見基因擴(kuò)增,HER2蛋白1+者11例HER2基因擴(kuò)增僅1例,C-erbB-2蛋白陰性病例共25例均未檢測到基因擴(kuò)增。本組結(jié)果顯示IHC檢測C-erbB-2蛋白與FISH檢測HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)有較高的一致性且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(k=0.681,P=0.000);其中C-erbB-2蛋白陰性和3+病例與HER2基因擴(kuò)增陰性和陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例與 HER2基因是否擴(kuò)增(陰/陽性率比較)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 乳腺癌HER2/neu基因擴(kuò)增與C-erbB-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 1 The correlation of Her-2 gene amplification and C-erbB2 protein in breast cancer

討 論

乳腺癌組織中有無 HER2基因擴(kuò)增和蛋白過度表達(dá),對于判斷患者的預(yù)后、預(yù)測臨床療效以及選擇使用赫賽汀生物靶向治療有重要意義,因此準(zhǔn)確檢測HER2基因和蛋白狀況極為關(guān)鍵。

在多種檢測手段中,以IHC和FISH應(yīng)用較多,FISH檢測目的物為相對穩(wěn)定的DNA,檢測過程較少受人為因素的影響,判讀標(biāo)準(zhǔn)客觀,可操作性強(qiáng),特異性高,是檢測 HER2基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)[5],但因價(jià)格昂貴,且對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高,一般實(shí)驗(yàn)室難以開展。而 IHC檢測物為CerbB-2蛋白,其特異性低于 FISH法,但卻有較高的敏感性,由于IHC方法固有的特點(diǎn)及制片效果、判讀因素使不同醫(yī)院間的結(jié)果差異較大。因此現(xiàn)在較多研究者認(rèn)為對于IHC檢查C-erbB-2蛋白陽性患者均應(yīng)行FISH復(fù)查[6,7]。本研究將IHC和 FISH方法進(jìn)行對比分析,希望尋找到最合理的復(fù)查模式。

本組58例乳腺癌中有 HER2基因擴(kuò)增者17例,檢出率為29.3%,我們的IHC和FISH實(shí)驗(yàn)分別在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室完成,在各自實(shí)驗(yàn)結(jié)束后才進(jìn)行結(jié)果比對,在蛋白表達(dá)為0和3+的病例,其與FISH檢測結(jié)果的符合率分別達(dá)到了 100%(25/25)和91.7%(11/12),與國內(nèi)外研究結(jié)果一致[8,9]。在C-erbB-2蛋白3+者12例中僅1例未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的基因擴(kuò)增,占無擴(kuò)展病例的2.4%(1/ 41),在推測本例可能出現(xiàn)IHC結(jié)果假陽性時(shí),也不能排除FISH實(shí)驗(yàn)中偶爾產(chǎn)生的誤差情況。實(shí)驗(yàn)表明這兩組病例IHC和FISH結(jié)果具有較高的一致性和吻合性(k=0.681,P<0.01),因此我們認(rèn)為只要前期組織處理得當(dāng),IHC實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格質(zhì)量控制,對于IHC檢測C-erbB-2蛋白陰性標(biāo)本無需再做FISH檢測;而 IHC檢測C-erbB-2蛋白3+病例出現(xiàn)假陽性率極低,出于衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的觀點(diǎn),一般情況下不必強(qiáng)調(diào)增做FISH檢查。

事實(shí)上IHC與FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比主要集中在C-erbB-2蛋白表達(dá)1+和2+的病例,我們的這兩組病例C-erbB-2蛋白表達(dá)與 HER2基因擴(kuò)增陽性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其結(jié)果的一致性和吻合性都存在明顯的差異,特別是2 +病例組的誤差達(dá)到了50%(5/10),與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道C-erbB-2蛋白2+病例FISH陽性率為25%-76.19%結(jié)果一致[9,10]。因此我們認(rèn)為這類病人必須增做FISH檢查(尤其是C-erbB-2蛋白表達(dá)2+的病例),以獲得準(zhǔn)確的HER2狀況。

基于IHC和FISH法各自的特點(diǎn),在乳腺癌病理診斷實(shí)際應(yīng)用中將兩者結(jié)合,IHC作為主要的檢測手段,對于蛋白表達(dá)陰性或陽性3+者可直接報(bào)告臨床,作為 Herceptin分子靶向治療的依據(jù),而對于蛋白表達(dá)1+和2+病例(特別是2+者)應(yīng)進(jìn)一步行FISH檢查,以明確是否有HER2基因擴(kuò)增,為臨床判斷預(yù)后和選擇治療提供科學(xué)依據(jù)。

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圖 版 說 明

圖1 C-erbB-2蛋白1+,瘤細(xì)胞不完整的胞膜著色,IHC

SP法 ×400

圖2 C-erbB-2蛋白2+,<30%瘤細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的胞膜著色,IHC SP法 ×400

圖3 C-erbB-2蛋白3+,多數(shù)瘤細(xì)胞呈強(qiáng)而完整的胞膜著色,IHC SP法 ×400

圖4 HER2基因擴(kuò)增,瘤細(xì)胞核內(nèi)紅色信號(hào) >2個(gè), FISH法 ×1000

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of C-erbB2 protein is positive.there is no tintegrity staining in the cell membrane.IHC S-P method×400

Fig.2 Expression of C-erbB2 protein is moderately positive.There are strong and integrity staining in the cell membrane,but less than 30%.IHC S-P method ×400

Fig.3 Expression of C-erbB2 protein is strongly positive.There are strong and integrity staining of cell membrane.IHC S-P method×400

Fig.4 Her-2 gene amplication,the number of red signal in nucleus is more than two.FISH method×1000

DETECTIONOF HER-2 GENE BY FISHAN D IHC INDIAGN OSIS AN D TREATMENT OF BREST CANCER

Guo Huaxiong1,Deng Mingfeng2,Chen Dengfeng3,Zhang Liu1,Yuan Lu1,Liu Jing1, Yang Yong1,Xu Zhengfeng3,Wang Changfu2＊
(1Department of Pathology,2The Centre of laboratory,3Department of Breast,Institute of Jingzhou Hospital of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou434020,China)

Objective To compare the clinical significance between detecting C-erbB2 protein expression by immunohistochemistry(IHC)and detecting Her-2 gene amplification by flurescence in situ hybridization(FISH)in breast cancer.Methods The expression of C-erbB2 protein and Her-2 gene amplification in 58 cases of breast cancer were detected by IHC and FISH respectively,and the concordance between them was analyzed.Results Of 58 cases,the expression of C-erbB2 protein was strongly and moderately positive in 22 cases(37.9%),and the Her-2 gene amplification existed in 17 cases(29.3%).In 12 cases where the expression of C-erbB2 protein was strongly positive by IHC,Her-2 gene amplification exsited in 11 cases.In 10 cases where the expression of C-erbB2 was moderately positive,Her-2 gene amplification exsited in 5 cases.In 11 C-erbB2 weakly positive cases,Her-2 gene amplication exsited in only 1 case.But in 25 C-erbB2 negative cases,none was amplied.Those data showed good concordance between the two methods,(κ=0.681,P<0.01).In addition,for the cases with strongly positive or negative expression, the difference between IHC and FISH was not statistically significant(P>0.05),but for the cases with moderately and weakly positive expression,the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion There is favourable concordance between Her-2 gene amplification and strongly positive or negative c-erB2 expression.It can be a evidence to decide whether use herceptin in clinical therapy or not.But for the moderately and weakly positive cases,FISH must be applied.

Breast cancer;Her-2/neu;Protein;FISH;IHC

R737.9

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.008

2010-04-06

2010-05-05

衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目(WKJ2007-3-001)

郭華雄,男(1963年),漢族,主任醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)