馮振中 陳嘉薇羅彥麗 王 萍 承澤農(nóng)

(蚌埠醫(yī)學院病理學教研室,蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科,安徽233030;1上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院病理科,上海200080)

幽門螺桿菌L型感染及血管生成素的表達與胃癌血管生成的關系

馮振中 陳嘉薇1＊羅彥麗 王 萍 承澤農(nóng)

(蚌埠醫(yī)學院病理學教研室,蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科,安徽233030;1上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院病理科,上海200080)

目的 探討幽門螺桿菌L型(Hp-L)感染和血管生成素(Ang)在胃癌中的表達及與腫瘤血管生成的關系。方法 采用革蘭染色和免疫組化方法檢測84例胃癌和30例癌旁正常組織中 Hp-L型感染,應用免疫組化方法檢測Ang-1、Ang-2蛋白表達水平,計數(shù)微血管密度(MVD),結合臨床病理因素進行分析。結果 胃癌組織中 Hp-L型感染率、Ang-2陽性表達率、MVD值明顯高于正常組織(P<0.05),胃癌中Hp-L型感染與腫瘤分化程度、侵襲深度、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移有關(P<0.05),與Ang-2表達、MVD呈正相關。胃癌組織中Ang-2表達與腫瘤大小、侵襲深度、淋巴結轉(zhuǎn)移有關(P<0.05),與MVD呈正相關。Ang-1在胃癌中表達略低于對照組,但無統(tǒng)計學差異(P>0.05),Ang-1表達與侵襲深度和MVD呈負相關。結論 胃癌 Hp-L型感染在腫瘤血管生成中起重要作用,其機制與Ang-2表達上調(diào), Ang-2/Ang-1比例失衡有關。

胃癌;幽門螺桿菌;血管生成素

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,侵襲、轉(zhuǎn)移是影響患者預后的重要因素,腫瘤性血管生成在其中發(fā)揮關鍵作用。幽門螺桿菌感染與慢性胃炎、胃癌等疾病的發(fā)生密切相關[1],已被WHO定為一級致癌物。Hp在不利于其生長繁殖的環(huán)境中易發(fā)生細胞壁缺陷而形成 Hp-L型(Helicobacter pylori L-form,Hp-L),具有更強的潛伏性和侵襲性[2]。血管生成素(angiopoietin,Ang)是一類新的內(nèi)皮細胞生長因子,對血管生成具有雙向調(diào)節(jié)作用,體現(xiàn)了機體內(nèi)精細的調(diào)控機制[3]。迄今,Hp-L型及血管生成素在胃癌腫瘤血管生成中的作用尚不明確,本研究旨在探討 Hp-L型、Ang-1、Ang-2在胃癌中的表達狀況,以及與微血管密度(microvessel density,MVD)和臨床病理指標的關系,為腫瘤治療提供科學依據(jù)。

材料和方法

1.研究對象

標本取自蚌埠醫(yī)學院附屬醫(yī)院2004至2006年手術切除并經(jīng)病理證實的胃癌標本84例,手術前未接受放療或化療。其中男性59例,女25例。年齡36-85歲,平均年齡57歲。高分化30例,中度分化32例,低分化 22例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國抗癌聯(lián)合會(AJCC)的 TNM分期標準:Ⅰ-Ⅱ期38例,Ⅲ-Ⅳ期46例。有淋巴結轉(zhuǎn)移者49例,無轉(zhuǎn)移者35例。隨機選取30例距腫瘤5㎝以上且經(jīng)病理證實為正常胃組織作為對照組。

2.方法和試劑

所有標本以甲醛固定,石蠟包埋常規(guī)制片,羊抗人Ang-1、Ang-2多克隆抗體(工作濃度1:75, 1:50)購自美國Santa Cruz公司,鼠抗人CD34單克隆抗體(工作濃度1:100),兔抗人 Hp多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。SP試劑盒和DAB顯色液購自福州邁新生物技術有限公司。嚴格按照免疫組化 SP實驗步驟進行,以PBS代替一抗為陰性對照,已知陽性切片作為陽性對照。革蘭染色按常規(guī)染色進行。

3.結果判斷

Hp-L型感染的判斷標準[4]:革蘭染色和免疫組化染色兩者均陽性者視為 Hp-L型感染陽性。革蘭染色:油鏡(10×100)觀察并計數(shù),每例隨機觀察10個視野取平均數(shù),Hp-L型平均數(shù)≥20為陽性,<20為陰性。Hp-L型多為圓球體,革蘭染色大多呈紅色,少數(shù)為紫紅色。Hp呈螺旋形、海鷗形等形態(tài),革蘭染色紅色。免疫組化染色:以腫瘤細胞、胃黏膜上皮細胞的胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色細顆粒為Hp-L型陽性,出現(xiàn)棕黃色螺旋形、長桿狀、S形等著色為Hp陽性。

Ang-1,2陽性標準:以染色強度和陽性細胞比例評定陽性表達,細胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)定位明確、染色明顯的棕黃/棕褐色顆粒為陽性細胞,所占比例≥10%為陽性病例。MVD判定標準,低倍鏡(×40)下選血管密集區(qū),以高倍鏡(×200)下計算3個視野中血管數(shù),取均值為微血管密度。以棕黃染的分界清楚的單個內(nèi)皮細胞或細胞團作為計數(shù)單位,不管成腔與否均視為新生的血管。具有較厚肌層的脈管除外。

4.統(tǒng)計學處理

結 果

1.胃癌中 Hp-L型感染、Ang-1、Ang-2和MVD的表達

84例胃癌中Hp-L型革蘭染色陽性61例(圖1),免疫組化染色陽性65例(圖2),兩者同時陽性者57例(67.9%),明顯高于癌旁正常組織的23.3%(P<0.01)。胃癌中Ang-1蛋白表達陽性率為40.5%,略低于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ang-2陽性率為53.8%,明顯高于正常組織(P<0.01),陽性產(chǎn)物定位于癌細胞和胃粘膜細胞的胞質(zhì),部分見于血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì),呈棕黃色顆粒狀(圖3)。胃癌組織中MVD值明顯高于正常組織(P<0.01),新生腫瘤血管分布于腫瘤間質(zhì)和周邊,壁薄,多為單層,大小不一,形態(tài)不規(guī)則(圖4)。

2.胃癌中Hp-L型感染和Ang-1、Ang-2的表達與臨床病理指標的關系

經(jīng)統(tǒng)計學分析,Hp-L型感染與腫瘤分化程度、侵襲深度、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移相關(P<0.05),Ang-2表達與腫瘤大小、侵襲深度、淋巴結轉(zhuǎn)移有明顯關系(P<0.05),Ang-1蛋白隨著腫瘤侵襲深度的增加而表達降低(P<0.05)。上述指標與患者年齡、性別、部位、組織學類型均無明顯關聯(lián)性(P>0.05,表1未列出)。

表1 Hp-L型感染、Ang-1和Ang-2表達與胃癌臨床病理指標的關系Table 1 Correlation between Hp L-form infection,expression of Angs and clinicopathological features in gastric carcinoma

3.胃癌中Hp-L型感染、Ang-1、Ang-2的表達和MVD的相互關系

Hp-L型感染組和Ang-2陽性組MVD分別為32.60±6.63、34.59±5.88,明顯高于陰性組21.96±4.39、22.93±4.23,兩者表達與MVD呈正相關(r=0.671,P<0.01,r=0.802,P<0.01)。Ang-1陽性組MVD值(25.44±7.27)明顯低于陰性組(31.72±7.14),兩者呈負相關(r =0.401,P<0.01)。Spearman等級相關分析表明Hp-L型感染和Ang-2表達呈正相關關系(r= 0.330,P=0.002)。

討 論

Hp是世界上最常見的細菌感染之一,并已研究證明是慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌等病變的確切致病因子,Hp-L型是細菌對不良環(huán)境耐受適應的一種形式[5],具有更大的潛伏性和危險性。本研究結果顯示,胃癌中Hp-L感染率高于正常組織,并與腫瘤分化、侵襲深度、臨床分期和淋巴結轉(zhuǎn)移有關,說明Hp-L感染在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。可能機制包括:①Hp-L型與 Hp在生物學性狀和細胞蛋白方面具有高度一致性[6],Hp-L型可通過Hp的重要致病成分對胃黏膜上皮產(chǎn)生反復損傷,誘導細胞突變;②Hp-L型球形小體的體積與病毒大小近似[7],本實驗觀察發(fā)現(xiàn),Hp-L型可以黏附在癌細胞表面并定位于細胞胞質(zhì)內(nèi),提示Hp-L型具有病毒類似的致病性,能夠整合到宿主體細胞中,引起細胞突變而致癌。

血管生成素是近年來發(fā)現(xiàn)的唯一既含受體激動劑又含受體拮抗劑的促血管生成家族,其中Ang-1可促進血管成熟并穩(wěn)定血管結構,Ang-2是Ang-1的生理拮抗劑,過度表達時抑制血管穩(wěn)定作用,促進血管出芽、生長。研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中均可出現(xiàn)Ang-2的過表達,并與腫瘤的惡性生物學行為有關。Mitsuhashi等[8]報道,肝癌中 Ang-2的表達明顯高于正常肝組織,Ang-2/Ang-1的比值與腫瘤直徑、肝癌門靜脈侵犯和MVD呈正相關,比值升高,患者預后不良。這與本研究的結果相似,Ang-1和Ang-2在胃癌和正常組織分布明顯不平衡,在腫瘤中Ang-2高表達,Ang-1相對低表達,在正常組織中表達則相反。

本實驗結果還提示胃癌Hp-L型感染和Ang-2表達及MVD具有正相關關系,說明Hp-L型感染可誘導 Ang-2蛋白高表達,促進胃癌血管生成,可能因素包括:①細胞因子:Hp-L型感染長期損傷胃黏膜組織,可引起嚴重的炎癥反應,刺激機體產(chǎn)生細胞因子和炎癥介質(zhì),進一步誘導Ang-2等血管生成因子釋放,促進血管生成;②缺氧:Hp-L型感染導致炎性滲出液大量聚集,同時腫瘤細胞增殖較快,導致局部血供不足,缺氧誘導因子大量產(chǎn)生,增強其下游靶基因Ang-2表達,促進血管生成,而新生的腫瘤血管發(fā)育不成熟,通透性高,更易于腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移。

總之,本研究顯示在胃癌組織中 Hp-L型感染、Ang-2和Ang-1的表達不平衡在腫瘤血管生成中具有重要作用?？?Hp-L型治療或以Ang-2、Ang-1為靶基因,抑制新生血管的生成,具有潛在的臨床應用價值。

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圖 版 說 明

圖1 胃癌中Hp-L型感染(革蘭染色×1000)。

圖2 胃癌中 Hp-L型免疫組化染色陽性表達(SP法 × 400)。

圖3 胃癌中 Ang-2陽性表達,定位于胞質(zhì)(SP法 × 400)。

圖4 胃癌中CD34染色的微血管的表達(SP法 ×200)。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Positive expression ofHp-Lin gastric carcinoma(Gram staining×1000).

Fig.2 Positive expression of Hp-Lby immunohistochemistry staining in gastric carcinoma(SP method×400).

Fig.3 Positive expression of angiopoietin-2 protein is located in cytoplasm(SP method×400).

Fig.4 Positive expression of CD34 in gastric carcinoma(SP method×200).

THE RELATIONSHIP BETWEEN HELICOBACTER PYLORI L-FORM INFECTION, ANGIOPOIETIN EXPRESSION AND ANGIOGENESIS OF GASTRIC CANCER

Feng Zhenzhong,Chen Jiawei1＊,Luo Yanli,Wang Ping,Cheng Zenong
(Department ofPathology,Bengbu Medical College,A nhui233030;1Department of Pathology,The First People′s Hospital,S hanghai J iaotong University,S hanghai200080,China)

Objective To investigate the expressions of Hp-Linfection and angiopoietins and their relationship with angiogenesis in gastric carcinoma.Methods Hp-Lwas detected in 84 cases of primary gastric cancer and 30 adjacent normal tissues by Gram staining and immunohistochemistry.The expressions of Ang-1,Ang-2 and CD34 were examined by immunohistochemistry.Results There were significant differences between Hp-Linfection,Ang-2 expression and MVD in gastric cancer and in adjacent normal tissue(P<0.05),but Ang-1 expression had no statistical difference(P>0.05).The expression of Ang-2 and MVD in the Hp-Linfection group were remarkable higher than those in the Hp-Lnegative group(P <0.05),with positive correlations between Hp-Land Ang-2 expression and MVD in tumors.The expression of Ang-2 was related with tumor size,depth of invasion and lymph node metastasis(P<0.05),with a positive correlation with MVD.There was a negative correlation between Ang-1 and MVD in tumors(P <0.05).Conclusion Hp-Linfection may play an important role in angiogenesis of gastric cancer via increasing Ang-2 protein dominant expression against Ang-1 protein.

Gastric carcinoma;Helicobacter pylori;Angiopoietin

R735.2

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.007

2010-01-23

2010-04-25

馮振中,男(1975年),漢族,碩士,講師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)