陳 帥，劉 娟，王蔭榆，吳正鈞，劉振民

(上海光明乳業(yè)技術(shù)中心，上海200072)

植物乳桿菌ST-Ⅲ菌株降膽固醇影響因素的研究

陳 帥，劉 娟，王蔭榆，吳正鈞，劉振民

(上海光明乳業(yè)技術(shù)中心，上海200072)

研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降低膽固醇作用受膽鹽和膽固醇影響。在培養(yǎng)基中添加不同的膽鹽，能增加ST－Ⅲ菌株降膽固醇能力，依次為?；悄懰徕c＞牛膽鹽＞膽酸，當(dāng)牛膽鹽的添加濃度為3.0g/L時(shí)，降膽固醇率達(dá)到最高值38.57%;在培養(yǎng)基中添加不同來(lái)源和不同濃度的膽固醇，ST－Ⅲ菌株均具有降低作用，但降低能力有差異，依次為羊血清＞雞蛋黃＞卵磷脂－膽固醇膠束溶液，且降低能力受膽固醇的濃度影響較大，當(dāng)濃度低于0.5mg/mL時(shí)，降膽固醇率可維持在40%左右，高于0.5mg/mL時(shí)，降膽固醇效果則顯著降低;降膽固醇量在膽固醇濃度為1.0mg/mL時(shí)達(dá)到最高值307μg/mL，這可能是高濃度膽固醇抑制ST－Ⅲ菌株的生長(zhǎng)所致。

植物乳桿菌ST－Ⅲ，降膽固醇，影響因素

Abstract:The influence of cholesterol and bile salts on cholesterol removal ability were tested.The cholesterol removal ability could be increased by adding bile salts into the media，the ability was in order of sodium taurocholic acid ＞ ox bile salt＞ cholic acid.When the concentration of ox bile salt was 3.0g/L，the cholesterol degradation rate reached the highest value 38.57%.ST－Ⅲ could remove cholesterol in different resources of cholesterol，the ability was in the order of sheep serum ＞egg yolk＞ cholesterol－phosphatidylcholine micelles.Cholesterol concentration had influence on its removal by ST－Ⅲ，when the concentration was less than 0.5mg/mL in the medium，the degradation rate maintained around 40%.When higher than 0.5mg/mL，the degradation became decreased with the concentration increased.And the removing content reached the highest value 307μg/mL at the concentration 1.0mg/mL.

Key words:Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ;cholesterol removal;influence factors

心血管疾病患病率和死亡率的逐年上升成為引起人類死亡的主要?dú)⑹帧Ｑ逯械哪懝檀急徽J(rèn)為是誘發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。因此，降低血清中膽固醇的水平直接關(guān)系到人類的健康。國(guó)內(nèi)外均有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)外具有降低膽固醇的益生功能，植物乳桿菌ST－Ⅲ是一株經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有降膽固醇作用的菌株。本文通過(guò)將植物乳桿菌 ST－Ⅲ接種于MRS－THIO液體高膽固醇培養(yǎng)基，研究其在不同培養(yǎng)條件下對(duì)膽固醇的降低情況，了解植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇特性，為進(jìn)一步研究植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇機(jī)理做好前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ST－Ⅲ 光明乳業(yè)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保藏;MRS液體培養(yǎng)基、MRS－THIO液體培養(yǎng)基 在MRS－broth中加入0.2%巰基乙酸鈉(THIO);MRSTHIO液體高膽固醇培養(yǎng)基 在MRS－THIO液體培養(yǎng)基中添加一定量的膽固醇源;?；悄懰徕c、水溶性膽固醇 Sigma公司;鄰苯二甲醛 上海醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;巰基乙酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯甲烷 上海試劑一廠。

pH酸度計(jì) 奧立龍公司;高速冷凍離心機(jī)BECKMAN COULTER公司;厭氧培養(yǎng)箱 RUSKINN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽固醇源的制備方法 無(wú)菌雞蛋黃液的制備:市售新鮮草雞蛋數(shù)枚，無(wú)菌操作下在雞蛋一端開(kāi)口，自然流出蛋清，打開(kāi)雞蛋得到無(wú)菌蛋黃，無(wú)菌吸取蛋黃液到無(wú)菌羅口瓶，4℃保存作為膽固醇源待用。無(wú)菌羊血清的制備:羊血清經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾，4℃保存作為膽固醇源待用。卵磷脂－膽固醇膠束溶液的制備:參照文獻(xiàn)［1］。4℃保存，當(dāng)天使用，0.22μm膜過(guò)濾后作為膽固醇源待用。

1.2.2 膽固醇濃度的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［2］，制得膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用鄰苯二甲醛法測(cè)定膽固醇含量［3］，根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出膽固醇的含量。

1.2.3 樣品處理及降膽固醇率的計(jì)算 將待測(cè)培養(yǎng)液進(jìn)行高速冷凍離心(12000r/min，10min，4℃)，得到的上清液直接用于測(cè)定膽固醇，膽固醇降低率的計(jì)算公式［4］為:

其中:A為各實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液的A550;C為空白對(duì)照的A550;D為膽固醇降低率。

1.2.4 膽鹽對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響

1.2.4.1 植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株對(duì)不同膽鹽的耐受力 實(shí)驗(yàn)分別采用牛膽鹽、膽酸和牛磺膽酸鈉作為不同膽鹽來(lái)檢測(cè)植物乳桿菌ST－Ⅲ的膽鹽耐受力。測(cè)定方法參照 Gilliland and Walker［2］，在 MRS－THIO培養(yǎng)基中分別添加0.3%(w/v)的膽鹽，空白對(duì)照組為MRS－THIO培養(yǎng)基，1%量接入植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株后37℃培養(yǎng)。每隔1h測(cè)定培養(yǎng)液在620nm處的吸光值及pH，以A620到達(dá)0.3的時(shí)間差作為菌株膽汁耐受力的評(píng)判依據(jù)。

1.2.4.2 不同膽鹽對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 參考Liong M.T.的方法［5］，將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于分別添加0.3%牛膽鹽、膽酸和牛磺膽酸鈉的MRS－THIO液體高膽固醇培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中膽固醇濃度約300μg/mL)，37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行膽固醇含量測(cè)定并計(jì)算降低率。

1.2.4.3 膽鹽濃度對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于不同牛膽鹽濃度的MRS－THIO液體高膽固醇培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中牛膽鹽的終濃度分別為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L［6］，37℃培養(yǎng) 24h 后測(cè)定膽固醇含量并計(jì)算降低率。

1.2.5 膽固醇對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響

1.2.5.1 膽固醇源對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS－THIO液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別加入羊血清、雞蛋黃以及膽固醇膠束溶液作為膽固醇源，37℃培養(yǎng)24h后測(cè)定膽固醇含量并計(jì)算降低率。

1.2.5.2 膽固醇濃度對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響 將植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS－THIO液體高膽固醇培養(yǎng)基，膽固醇膠束溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中膽固醇含量，使之分別為 0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL［7］，37℃ 培養(yǎng) 24h 后測(cè)定膽固醇含量并計(jì)算降低率。

2 結(jié)果與討論

2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

以膽固醇濃度對(duì) A550作圖，得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 膽固醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株對(duì)不同膽鹽的耐受力

表1為在MRS－THIO培養(yǎng)基中添加牛膽鹽、膽酸和?；悄懰徕c時(shí)植物乳桿菌ST－Ⅲ的生長(zhǎng)情況，以不添加任何膽鹽的MRS－THIO培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。其中膽酸為游離膽酸，?；悄懰徕c為結(jié)合型膽鹽，牛膽鹽則為游離膽酸與結(jié)合型膽鹽的混合物。從表1中可以看出，在含不同膽鹽的培養(yǎng)基中ST－Ⅲ菌株所表現(xiàn)出的耐膽鹽能力不同，對(duì)?；悄懰徕c的耐受力最強(qiáng)，與對(duì)照組相比遲滯時(shí)間僅為0.31h;對(duì)牛膽鹽與膽酸的耐受力較弱，遲滯時(shí)間分別為3.75h與3.42h。雖然含膽酸的培養(yǎng)基初始pH最低，但這不是導(dǎo)致ST－Ⅲ菌株生長(zhǎng)緩慢的主要原因，Liong［5］也在其實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同的初始pH對(duì)于菌體生長(zhǎng)以及耐膽鹽能力的影響非常小。由此，可以得知植物乳桿菌ST－Ⅲ對(duì)結(jié)合型膽鹽的耐受能力較強(qiáng)，而對(duì)游離膽酸以及混合型膽鹽的耐受能力較弱。

表1 植物乳桿菌ST－Ⅲ對(duì)不同膽鹽的耐受能力

2.3 不同膽鹽對(duì)降膽固醇作用的影響

Klaver［8］等研究者提出，細(xì)菌從培養(yǎng)基中去除膽固醇是游離膽酸和膽固醇在pH低于5.5時(shí)共同沉淀的結(jié)果，乳酸菌通過(guò)水解結(jié)合型膽鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x膽酸，因后者的溶解度降低與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用，因此，培養(yǎng)基中的膽鹽存在與否，膽鹽的結(jié)合狀態(tài)都會(huì)影響乳酸菌的降膽固醇作用。實(shí)驗(yàn)選用三種不同類型的膽鹽來(lái)研究膽鹽對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響。

從圖2中可以看出，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株在含不同膽鹽培養(yǎng)基中的降膽固醇能力雖有所不同，但差別不大。其中對(duì)結(jié)合型膽鹽－牛磺膽酸鈉培養(yǎng)基的降膽固醇作用最強(qiáng)，降解率可達(dá)44.0%;其次為混合型膽鹽培養(yǎng)基，降解率為39.7%;游離膽酸－膽酸培養(yǎng)基降膽固醇作用較弱，但也達(dá)到了32.6%。結(jié)合植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株對(duì)不同膽鹽的耐受力進(jìn)行比較，在生長(zhǎng)狀態(tài)最好的?；悄懰徕c培養(yǎng)基中降膽固醇能力最強(qiáng)，而在生長(zhǎng)較弱的膽酸和牛膽汁中降膽固醇能力較弱。這表明植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用與菌體生長(zhǎng)存在著一定的相關(guān)性;但不同膽鹽對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用影響不大，因此我們推測(cè)植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇作用以同化作用為主，但這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

圖2 ST－Ⅲ在不同膽鹽培養(yǎng)基中的降膽固醇能力

2.4 膽鹽濃度對(duì)降膽固醇作用的影響

從圖3中可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中不含膽鹽時(shí)，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有一定的降膽固醇作用，但效果不明顯;當(dāng)培養(yǎng)基加入膽鹽后，降膽固醇作用呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基中膽鹽濃度為3.0g/L時(shí)，降膽固醇作用最強(qiáng)，降膽固醇率可達(dá)38.57%，此后隨著培養(yǎng)基中膽鹽濃度的增高降膽固醇作用開(kāi)始降低，這有可能是由于膽鹽濃度過(guò)高抑制了菌體生長(zhǎng)所致。但這一現(xiàn)象并不能說(shuō)明植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇方式以沉淀作用為主，有研究人員發(fā)現(xiàn)，在其培養(yǎng)的14株乳桿菌中，在不添加膽鹽培養(yǎng)時(shí)，上清液膽固醇濃度幾乎沒(méi)有變化，在沒(méi)有膽鹽存在的條件下同化作用和共沉淀作用均未發(fā)生。提出膽鹽的存在不僅能促使膽固醇共沉淀作用的發(fā)生，還能增加細(xì)胞膜通透性，利于膽固醇的同化作用［9］。由此我們推測(cè)對(duì)于植物乳桿菌ST－Ⅲ，隨著膽鹽濃度的增高不僅沉淀作用增強(qiáng)，同化作用也得到提高。這在后期實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)，在含有0.3%牛膽鹽的MRS－THIO高膽固醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的同化作用降膽固醇率達(dá)到25.5%，明顯高于不添加膽鹽培養(yǎng)的降膽固醇率7.79%，同化作用增強(qiáng)。

2.5 膽固醇源對(duì)降膽固醇作用的影響

降膽固醇乳酸菌在篩選過(guò)程中，膽固醇源的不同導(dǎo)致菌體的降膽固醇能力有所差別。文獻(xiàn)中所涉

及到的膽固醇源有血清［10－11］、雞蛋黃［12－13］、卵磷脂－膽固醇膠束溶液［1，6，14］、膽固醇乙醇溶液［15］等，還有研究直接利用膽固醇含量高的食品基質(zhì)(奶油)來(lái)作為培養(yǎng)基篩選目的菌種［16－17］。由于膽固醇在水中的溶解性極差，一般的方法無(wú)法使其在培養(yǎng)基中均勻分布，而血清與雞蛋黃屬于天然高膽固醇產(chǎn)物，其富含的其他物質(zhì)可幫助膽固醇均勻分布于培養(yǎng)基中，是培養(yǎng)基中膽固醇的較適合來(lái)源。因此本實(shí)驗(yàn)選用血清、蛋黃和卵磷脂－膽固醇膠束溶液作為不同的膽固醇源測(cè)定植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇能力。

圖3 膽鹽濃度對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ降膽固醇作用的影響

從圖4中可以看出，在膽固醇初始濃度相同的條件下，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株在不同膽固醇源中的降膽固醇能力有所差別，降膽固醇能力依次為羊血清＞雞蛋黃＞卵磷脂－膽固醇膠束溶液，這可能是由于血清和蛋黃中含有的其他物質(zhì)引起的。從圖中還可以看出隨著溶液中膽固醇初始濃度的增大，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇含量也隨之升高，膽固醇的降低率基本恒定，這說(shuō)明植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有較穩(wěn)定的降低膽固醇能力。

圖4 ST－Ⅲ在不同膽固醇源中的降膽固醇能力

2.6 膽固醇對(duì)ST－Ⅲ菌株生長(zhǎng)曲線的影響

圖5所顯示的是植物乳桿菌ST－Ⅲ在添加與不添加膽固醇膠束溶液兩種狀態(tài)下的生長(zhǎng)曲線以及培養(yǎng)24h過(guò)程中降低膽固醇率的變化。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，降膽固醇率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。從圖中可以看出，在培養(yǎng)4h后，添加膽固醇培養(yǎng)的植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株較未添加相比生長(zhǎng)較快，在達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，A620處的吸光值已明顯高于不含有膽固醇培養(yǎng)基的植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株，這說(shuō)明膽固醇對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。從圖中還可以看出，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用與菌體生長(zhǎng)存在著一定的相關(guān)性，當(dāng)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，降膽固醇作用明顯增強(qiáng)，我們推測(cè)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用極有可能是菌株代謝產(chǎn)物的作用結(jié)果。

2.7 膽固醇濃度對(duì)降膽固醇作用的影響

膽固醇濃度對(duì)降膽固醇作用影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，膽固醇初始濃度不同，植物乳桿菌ST－Ⅲ所表現(xiàn)出的降膽固醇率以及降膽固醇含量也有所差異。從圖中可以看出，當(dāng)膽固醇初始濃度較低時(shí)，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇率維持在一個(gè)恒定的范圍內(nèi)，在40%左右;當(dāng)濃度大于0.5mg/mL時(shí)，降膽固醇率開(kāi)始呈下降趨勢(shì);而降膽固醇量一開(kāi)始則隨著膽固醇濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到1.0mg/mL時(shí)降低量達(dá)到最大值307μg/mL，此后則不再隨著濃度的升高而增大，開(kāi)始呈降低趨勢(shì)，這可能是膽固醇濃度過(guò)高抑制了菌體的生長(zhǎng)代謝所引起的。雖然降膽固醇含量在濃度為1.0mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，但從此處的降膽固醇率可以看出，菌體生長(zhǎng)已經(jīng)受到一定的抑制作用而使降膽固醇率有所下降，但由于培養(yǎng)基中膽固醇初始濃度高，以致于降膽固醇含量在濃度1.0mg/mL達(dá)到最高值。pH的測(cè)定也表明高濃度膽固醇會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，培養(yǎng)24h后分別測(cè)pH發(fā)現(xiàn)，低濃度膽固醇的pH在4.22～4.29之間;高濃度膽固醇的pH則依次為4.48、4.67、4.89，隨著膽固醇初始濃度的增高，pH相應(yīng)降低，菌株生長(zhǎng)受抑制程度加深。

圖5 ST－Ⅲ的生長(zhǎng)曲線與降膽固醇之間的關(guān)系

圖6 不同膽固醇濃度對(duì)膽固醇降解率的影響

3 結(jié)論

植物乳桿菌ST－Ⅲ對(duì)不同膽鹽的耐受力依次為?；悄懰徕c＞膽酸＞牛膽鹽;在培養(yǎng)基中添加不同膽鹽植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇能力不同，依次為?；悄懰徕c＞牛膽鹽＞膽酸;當(dāng)培養(yǎng)基中不添加膽鹽時(shí)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有一定的降膽固醇能力，但作用效果不強(qiáng);隨著培養(yǎng)基中膽鹽濃度的增高，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇能力呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)膽鹽濃度為3.0g/L時(shí)降膽固醇率達(dá)到最高值38.57%。

植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株具有穩(wěn)定的降膽固醇能力，對(duì)不同來(lái)源的膽固醇均具有降膽固醇作用，能力依次為羊血清＞雞蛋黃＞卵磷脂－膽固醇膠束溶液;在膽固醇濃度對(duì)其降膽固醇作用影響的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膽固醇濃度低于為0.5mg/mL時(shí)，植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇率恒定在40%左右，當(dāng)濃度高于0.5mg/mL時(shí)，降膽固醇能力隨著膽固醇濃度的增大而降低;在濃度為1.0mg/mL時(shí)，降膽固醇量達(dá)到最大值307μg/mL。

植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株的降膽固醇作用與菌體生長(zhǎng)存在著一定的相關(guān)性，菌體生長(zhǎng)處于優(yōu)勢(shì)則降膽固醇能力強(qiáng);膽鹽的結(jié)合狀態(tài)對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇作用的影響差別較小;這都暗示著植物乳桿菌ST－Ⅲ的降膽固醇作用以同化作用為主，當(dāng)然這還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Study on influence factors of cholesterol removal by Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ strain

CHEN Shuai，LIU Juan，WANG Yin－yu，WU Zheng－jun，LIU Zhen－min
(Technical Center，Bright Dairy ＆ Food Co.，Ltd.，Shanghai 200072，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0088－04

2009－04－27

陳帥(1984－)，男，碩士研究生，研究方向:食品微生物。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2007AA10Z353)。