何艷克，胡 飛

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

大麥芽中淀粉酶系活力的測(cè)定及其作用特性

何艷克，胡 飛

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

采用BPNPG7法、PNPβ-G3法和普魯蘭法分別測(cè)定大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力，探討溫度和pH值對(duì)大麥芽淀粉酶系活性的影響規(guī)律，并分析淀粉酶系的熱穩(wěn)定性及作用特性。結(jié)果表明：大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的最適溫度分別是70、60℃和55℃，最適pH值分別為5.5、5.5和5；α-淀粉酶熱穩(wěn)定性相對(duì)較高；β-淀粉酶在50℃和55℃時(shí)能保持良好的熱穩(wěn)定性；極限糊精酶熱穩(wěn)定性相對(duì)較差。α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶與水解體系還原糖含量有一定的關(guān)系。

大麥芽；淀粉酶；活力；測(cè)定；特性

Abstract ：The activities of alpha-amylase, beta-amylase and limit dextrinase in malt were measured by BPNPG7 method, PNP β-G3 method and pullulan method, respectively. Based on this investigation, the influences of temperature and pH value on the activity of the amylases were discussed and their thermal stability and hydrolysis performance were analyzed. The results showed the optimal reaction temperature for malt alpha-amylase, beta-amylase and limit dextrinase was 70, 60℃ and 55 ℃, and the optimal reaction pH values were 5.5, 5.5 and 5, respectively. The thermal stability of the alpha-amylase was better than that of two other amylases. Malt beta-amylase could retain good thermal stability at 50℃ and 55℃. Comparatively, malt limit dextrinase had poor thermal stability. In addition, these three amylases in malt presented certain relationships between activities at different reaction temperature and reducing sugar content in hydrolysis system.

Key words：malt；amylase；activity；determination；characteristics

淀粉是啤酒釀造的重要成分，其通過多種酶協(xié)同作用形成低分子寡糖方可被酵母利用[1]。與淀粉降解密切相關(guān)的大麥芽淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶等[2-4]。在淀粉酶解過程中，α-淀粉酶和β-淀粉酶不能水解支鏈糊精，兩者協(xié)同作用雖可加快淀粉的降解速度，并不能改變終產(chǎn)物組成。極限糊精酶具有高度特異性，專門水解支鏈淀粉和分支糊精中的α-1,6糖苷鍵，提高淀粉的水解率[5-7]。盡管早在1943年Myrback[8]報(bào)道了極限糊精酶的存在，但因其含量很少且難以檢測(cè)，一直以來在糖化過程中的重要作用并未受到重視。近年來，酶檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)為極限糊精酶性質(zhì)研究提供了重要平臺(tái)。目前，國(guó)外對(duì)極限糊精酶的作用、遺傳控制和表達(dá)特點(diǎn)有了不少研究[9-12]，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道很少[13-14]。

大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力是決定淀粉水解速率和終產(chǎn)物的重要參數(shù)。因此，對(duì)大麥芽淀粉酶系的性質(zhì)和作用規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)很有必要。本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)大麥芽淀粉酶系活力的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的作用特性，并探討它們與還原糖之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥芽(Gairdner、Sloop、Kendel、Metcalfe 和甘啤3號(hào)) 廣州麥芽公司。

BPNPG7、PNPβ-G3、普魯蘭試劑組 愛爾蘭Megazyme公司；3,5-二硝基水楊酸(DNS，分析純) 廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用有限公司；HH-2高精度恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏華儀器廠；PHS-25數(shù)字酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 α-淀粉酶活力的測(cè)定

采用BPNPG7法：稱取1.0g麥芽粉，加2g NaCl、0.04g CaCl2和0.04g疊氮化鈉，定容至200mL，室溫下浸提30min，離心取上清液以備用。以0.2mL BPNPG7和α-葡萄糖苷酶混合液為底物，40℃條件下與0.2mL酶提取稀釋液準(zhǔn)確反應(yīng)10min，于波長(zhǎng)410nm處測(cè)定吸光度。

酶比活力單位定義(U/g)：在40℃每分鐘催化底物釋放1mol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.3.2 β-淀粉酶活力的測(cè)定

采用PNPβ-G3法：稱取1.0g麥芽粉，加10.0mL浸提緩沖液，室溫下浸提1h，離心取上清液以用于β-淀粉酶活力測(cè)定。以0.2mL PNPβ-G3和β-葡聚糖酶混合液為底物，40℃條件下與0.2mL酶提取稀釋液準(zhǔn)確反應(yīng)10min，于波長(zhǎng)410nm處測(cè)定吸光度。

酶比活力單位定義(U/g)：在40℃每分鐘催化底物釋放1mol對(duì)硝基苯酚所需的酶量乘以55.5，換算為Betamy1方法底物條件下每分鐘釋放1mol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.3.3 極限糊精酶活力的測(cè)定

采用普魯蘭法：稱取1.0g麥芽粉，加入含20mmol/L Cys-HCl的0.2mol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.5)16mL，置于恒溫水浴搖床上，40℃、100r/min水浴16h，離心取上清液，與普魯蘭在40℃水浴10min，于波長(zhǎng)590nm處測(cè)定吸光度。

酶比活力單位定義(U/kg)：在40℃每分鐘催化底物所釋放的還原糖，其還原力相當(dāng)于1mg麥芽糖所需的酶量。

1.3.4 α-淀粉酶、β-淀粉酶及極限糊精酶熱穩(wěn)定性測(cè)定

調(diào)節(jié)α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶酶液的pH值分別為5.5、5.5和5，置于不同溫度水浴中分別作用10～50min后迅速冷卻至室溫，均在40℃條件下，測(cè)定酶活力。以未進(jìn)行溫度處理前的初始酶活力為100%，計(jì)算殘余酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種大麥芽α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力

測(cè)定不同品種大麥芽中淀粉酶活力，并與DNS法[15-17]進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。不同品種大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力差異較大，Gairdner、Sloop和Metcalfe淀粉酶含量相對(duì)較高。DNS法測(cè)定結(jié)果與BPNPG7、PNPβ-G3法有一定差異。DNS法主要根據(jù)α-淀粉酶和β-淀粉酶的酶學(xué)特性采用選擇性失活的技術(shù)來測(cè)定兩者的酶活力，有時(shí)由于兩者生化特性差異并不十分明顯會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。BPNPG7、PNPβ-G3采用底物酶解法測(cè)定，寡聚糖分別被內(nèi)源α-淀粉酶和β-淀粉酶水解后，產(chǎn)物再分別被α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶分解成還原糖和硝基苯酚后進(jìn)行測(cè)定。該方法可消除其他淀粉酶的干擾，結(jié)果更為合理、準(zhǔn)確。同時(shí)證實(shí)了極限糊精酶的存在，而且定量給出了其活力水平。

表1 麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力Table 1 Activities of α-amylase, β -amylase and limit dextrinase in malts from different barley varieties

2.2 大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的作用特性

2.2.1 溫度和pH值對(duì)大麥芽α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活性的影響

圖1 溫度(a)和pH值(b)對(duì)α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶酶活力的影響Fig.1 Effects of temperature and pH on malt α -amylase, β -amylase and limit dextrinase activities

溫度和pH值是影響酶活力的關(guān)鍵因素，分別在不同溫度和pH值條件下測(cè)定大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算各溫度和pH條件下相對(duì)酶活力，結(jié)果見圖1。

由圖1a可知，α-淀粉酶溫度作用范圍較寬，40～60℃酶活力受溫度影響不大，70℃左右酶活力達(dá)最大值；β-淀粉酶和極限糊精酶溫度作用范圍較窄，最佳酶活力溫度分別為60℃和55℃左右。圖1b表明α-淀粉酶和極限糊精酶受pH值影響較為明顯，分別在pH值5.5和5達(dá)到最大酶活力水平；β-淀粉酶受pH值影響相對(duì)不敏感，5.5為最佳作用pH值。

2.2.2 大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的熱穩(wěn)定性

圖2 大麥芽α -淀粉酶(a)、β -淀粉酶(b)和極限糊精酶(c)的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of maltα -amylase, β -amylase and limit dextrinase activity

由圖2可知，α-淀粉酶在60℃時(shí)較穩(wěn)定，30min時(shí)酶活力仍保存87.12%；在65℃時(shí)，酶活力衰減加劇，10min后殘余酶活力僅為68.96%；在70℃條件下，酶活力半衰期不足10min。β-淀粉酶在50℃和55℃條件下酶活力比較穩(wěn)定，60℃時(shí)酶活力迅速下降，30min后殘余酶活力為64.94%。極限糊精酶50℃時(shí)酶活力較為穩(wěn)定，60℃時(shí)失活率加劇，10min后殘余酶活力僅為28.18%。

2.3 α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶與還原糖之間的關(guān)系

圖3 α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶與還原糖之間的關(guān)系Fig.3 Change in reducing sugar content in hydrolysis system with reaction temperature for hydrolysis by maltα -amylase, β -amylase or limit dextrinase

α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶可將淀粉水解為小分子可發(fā)酵性糖，從而有利于酵母利用?？砂l(fā)酵性糖主要有葡萄糖、果糖、麥芽糖和麥芽三糖等，通過分析酶活力與還原糖含量之間的關(guān)系可研究淀粉酶的作用特性。由圖3可知，3種酶共同作用所產(chǎn)生的還原糖高于α-和β-淀粉酶兩酶、α-淀粉酶單酶作用體系，尤其在45～55℃三種酶共同作用體系還原糖增高趨勢(shì)相對(duì)明顯，推測(cè)極限糊精酶在此溫度范圍內(nèi)發(fā)揮了作用；α-和β-淀粉酶雙酶體系與α-淀粉酶單酶體系相比，55～65℃雙酶體系水解效果較好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了大麥芽中α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶的特性和作用規(guī)律。結(jié)果表明：大麥芽中淀粉酶系最適作用條件不同，且熱穩(wěn)定性存在明顯差異性。特別是極限糊精酶熱穩(wěn)定性相對(duì)較差，60℃條件下酶活力顯著衰減。同時(shí)，極限糊精酶與還原糖含量有一定相關(guān)性，在一定環(huán)境下具有不可忽略的作用。因此，在制麥或糖化過程中，應(yīng)根據(jù)各淀粉酶特性，制定合理的工藝條件，使其均能發(fā)揮最佳活力，特別是應(yīng)根據(jù)極限糊精酶特性，適當(dāng)延長(zhǎng)其作用時(shí)間，以提高淀粉的水解效率。

[1] 周廣田. 啤酒釀造技術(shù)[M]. 濟(jì)南: 山東大學(xué)出版社, 2005.

[2] MACGREGOR A W, BAZIN S L, MACRI L J, et al. Modelling the contribution of alpha-amylase, beta-amylase and limit dextrinase to starch degradation during mashing[J]. Journal of Cereal Science, 1999, 29:161-169.

[3] WOLFGANG K. 啤酒工藝實(shí)用技術(shù)[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社,1998.

[4] 汪軍妹, 楊建明, 沈秋泉, 等. 大麥β-淀粉酶的遺傳和環(huán)境變異及其與麥芽品質(zhì)的相關(guān)[J]. 大麥科學(xué), 2004(4): 14-17.

[5] 王洪振, 王淑范. 吉啤2號(hào)大麥發(fā)芽過程中極限糊精酶變化規(guī)律的研究[J]. 吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 26(4): 6-7.

[6] McDOUGALL G J, ROSS H A, SWANSTON J S, et al. Limit dextrinase from germinating barley has endotransglycosylase activity, which explains its activation by maltodextrins[J]. Planta, 2004, 218(4): 542-551.

[7] STENHOLM K, HOME S. A new approach to limit dextrinase and its role in mashing[J]. Journal of the Institute of Brewing, 1999, 105(4):205-210.

[8] MYRBACK K. Enzymic degradation of starch and the structure of the starch macromolecule[J]. Journal for Prakische Chemical, 1943, 162:29-62.

[9] MCCLEARY B V. Measurement of the content of limit dextrinase in cereal flours[J]. Carbohydrate Research, 1992, 227: 257-268.

[10] GIBSON T S, SOLAH V, GLENNIE HOLMES M R, et al. Diastatic power in malted barley: Contributions of malt parameters to its development and the potential of barley grain beta-amylase to predict malt diastatic power[J]. Journal of the Institute of the Brewing, 1995, 101(2):277-280.

[11] MacGREGOR E A. The proteinaceous inhibitor of limit dextrinase in barley and malt[J]. Biochimi Biophys Acta, 2004, 1696(2): 165-170.

[12] ROSS H A, SUNGURTAS J, DUCREUX L, et al. Limit dextrinase in barley cultivars of differing malting quality: activity, inhibitors and limit dextrin profiles[J]. Journal of Cereal Science, 2003, 38(3): 325-334.

[13] 李芬, 朱筱娟, 王興智. 啤酒大麥極限糊精酶的研究進(jìn)展[J]. 東北師大學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1998(4): 68-75.

[14] 王云飛, 王清路, 黃丹. 大麥芽中極限糊精酶活性測(cè)定條件的研究[J]. 中國(guó)釀造, 2008(18): 59-60.

[15] 聞年云. 啤酒糖化用α-淀粉酶活力的測(cè)定方法[J]. 廣州食品工業(yè)科技, 1995(3): 35-37.

[16] 李雯, 邵遠(yuǎn)志, 陳維信. 淀粉酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2005(5): 655-656.

[17] 田亞平, 郭鴻飛, 肖光焰, 等. 一種麥芽β-淀粉酶的純化和特性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2003, 24(9): 22-24.

Activity Determination and Characteristics of Malt Amylases

HE Yan-ke，HU Fei
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Q556

A

1002-6630(2010)15-0236-04

2010-04-25

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007A020100001-12)

何艷克(1986—)，女，碩士研究生，主要從事谷物化學(xué)與工程研究。E-mail：yuanhang1014@163.com