黃瓜抗病基因同源序列的表達(dá)分析

許春梅，秦智偉，丁國華，周秀艷

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025）

霜霉?。―owny Mildew）是一種危害黃瓜生產(chǎn)的世界范圍內(nèi)的葉部病害，如果防治不力則會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p失[1-2]。該病害在黃瓜整個(gè)生育期都能發(fā)生，主要危害黃瓜葉片，幼苗子葉期即可染病，子葉上出現(xiàn)褪綠色的不規(guī)則形小斑點(diǎn)，漸漸變成黃褐色。發(fā)病初期時(shí)，葉背或者葉緣出現(xiàn)水浸狀淡黃色的不規(guī)則小斑點(diǎn)，隨著病情發(fā)展，病斑會(huì)逐漸擴(kuò)大，沿著葉脈形成多角型黃色病斑。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)小病斑匯集成大病斑，潮濕條件下病斑背面會(huì)長(zhǎng)出灰黑色的霉層。發(fā)病葉由下向上發(fā)展，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致全株葉片枯萎。1～2周內(nèi)就能使瓜田全部枯黃，黃瓜產(chǎn)量下降，甚至造成絕產(chǎn)。

抗病基因類似序列（Resistance Gene Analog，RGA）是存在于植物基因組中與已分離出來的30多個(gè)抗病基因某些保守序列存在較高同源性的DNA片段[3]。RGA在植物基因組中大量存在，與抗病基因相關(guān)的RGA只是其中一部分[4]。不過就現(xiàn)有的RGA的研究來看，NBS類保守域基本只出現(xiàn)在抗病基因當(dāng)中，而STK（PK）類和LRR類的出現(xiàn)比較復(fù)雜。

RGA1、RGA2、RGA4、RGA5、RGA8和RGA10是己克隆的黃瓜抗病基因同源序列片段[3]，其中部分片段具有NBS類型抗病基因的磷酸結(jié)合環(huán)（p-Loop）和保守結(jié)構(gòu)域（Kinase2）結(jié)構(gòu)。與己克隆的甜瓜RGA基因存在較高的同源性。蛋白同源性分析顯示RGA的推測(cè)產(chǎn)物與幾百種蛋白質(zhì)存在很高的同源性，這些蛋白質(zhì)基本上都是假定的抗病蛋白[5]。

本研究基于RGA基因在黃瓜中的多態(tài)性特征及其產(chǎn)物的抗病蛋白同源性特征，采用半定量方法分析其在黃瓜植株各部位和霜霉菌誘導(dǎo)后各時(shí)期的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為黃瓜抗霜霉病品種東農(nóng)129，將種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，在人工氣候箱中按光照12 h、黑暗12 h的光周期，18～25℃下培養(yǎng)。在幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，接種霜霉菌，采樣時(shí)間為誘導(dǎo)后0、6、12、18、24、48、72 和 96 h，另對(duì)未做任何人工誘導(dǎo)的東農(nóng)129黃瓜植株材料的子葉、根、果實(shí)等采樣保存。

1.2 總RNA、DNA提取與完整性檢測(cè)

用上海生工的Trizol RNA提取試劑盒分別提取黃瓜真葉、子葉、莖、果實(shí)、根及接種霜霉菌不同時(shí)間段的真葉的RNA；用常規(guī)方法提取未經(jīng)人工接種霜霉菌的真葉總DNA；用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA和DNA的純度和濃度。

1.3 cDNA的合成

用試劑盒TaKaRaDRRT1900A合成cDNA。

1.4 定量

擴(kuò)增18S內(nèi)參基因，通過調(diào)整反應(yīng)體系中cDNA模板量和各種反應(yīng)底物的濃度，使瓊脂糖電泳上各誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)的PCR產(chǎn)物亮度一致。

1.5 黃瓜抗病基因同源序列RGA的擴(kuò)增

1.5.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)己獲得的黃瓜同源序列RGA基因的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物（見表1），由上海生工合成，PAGE純化。

表1 用于連鎖和資源分析的RGA特異引物Table1 Special primers of CsRGA for analysis of linkage and germplasm in cucumber

1.5.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，分別加入等量不同器官及誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)的cDNA（1 μL）及未做任何誘導(dǎo)的DNA模板（100 ng），10×PCR Buffer（Mg2+）2.5 μL，rTaqDNA 聚合酶（購自 TaKaRa 公司）0.2 μL（5 U·μL-1），dNTPs（購自TaKaRa公司）1.0μL（2.0mmol·L-1），上游引物1.0 μL（20 μmol·L-1），下游引物1.0 μL（20 μmol·L-1），ddH2O 17.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)在Eppendorf梯度PCR儀上進(jìn)行。取5 μL PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量

用半定量RT-PCR方法對(duì)黃瓜RGA基因進(jìn)行分析，18S基因在霜霉病誘導(dǎo)后不同時(shí)間的葉片中擴(kuò)增條帶亮度基本相同（見圖1），以此為對(duì)照分析了黃瓜抗病植株東農(nóng)129中RGA基因的表達(dá)情況。

2.2 霜霉菌誘導(dǎo)后RGA基因表達(dá)情況

RGA1基因在未誘導(dǎo)的黃瓜抗霜霉病品種東農(nóng)129葉片中有一定量表達(dá)，但表達(dá)相對(duì)含量較低，在其他組織中無表達(dá)，當(dāng)黃瓜植株受霜霉菌誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)18 h后表達(dá)水平明顯提高，誘導(dǎo)24 h相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高水平，48 h表達(dá)量下降（見圖2）。

圖1 接種霜霉病菌后的黃瓜18S基因的PCR產(chǎn)物的電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR product of 18S gene in cucumber inoculated with P.cubensis

圖2 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA1基因PCR產(chǎn)物的電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR product of RGA1 in cucumber inoculated with P.cubensis

RGA4基因在未誘導(dǎo)的黃瓜抗霜霉病品種東農(nóng)129植株子葉中無表達(dá)，在其他器官中均有表達(dá)，在霜霉菌誘導(dǎo)植株中也有表達(dá)，且表達(dá)量明顯增強(qiáng)（見圖 3）。

RGA5在未誘導(dǎo)霜霉病植株中均無表達(dá)，但誘導(dǎo)后12 h開始表達(dá)，24 h表達(dá)相對(duì)含量達(dá)最高水平，誘導(dǎo)后72 h表達(dá)量達(dá)誘導(dǎo)前水平（見圖4）。

圖3 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA4基因PCR產(chǎn)物的電泳Fig.3 Electrophoresis of PCR product of RGA4 in cucumber inoculated with P.cubensis

圖4 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA5基因PCR產(chǎn)物的電泳Fig.4 Electrophoresis of PCR product of RGA5 in cucumber inoculated with P.cubensis

由圖5可知，RGA8在抗霜霉病品種東農(nóng)129黃瓜植株經(jīng)霜霉菌誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，誘導(dǎo)后24 h表達(dá)達(dá)到高峰，然后慢慢減弱。在葉片以外部位仍表達(dá)，但表達(dá)量較弱。在霜霉菌誘導(dǎo)后總cDNA中仍有大量表達(dá)。

RGA10基因在抗霜霉病品種東農(nóng)129黃瓜植株經(jīng)霜霉菌誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，且誘導(dǎo)前后相對(duì)表達(dá)量無明顯差異（見圖6）。

圖5 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA8基因PCR產(chǎn)物的電泳Fig.5 Electrophoresis of PCR product of RGA8 in cucumber inoculated with P.cubensis

圖6 接種霜霉病菌后的黃瓜RGA10基因PCR產(chǎn)物的電泳Fig.6 Electrophoresis of PCR product of RGA10 in cucumber inoculated with P.cubensis

RGA2基因在抗病品種東農(nóng)129中經(jīng)霜霉菌誘導(dǎo)前后均有表達(dá)，在誘導(dǎo)后表達(dá)量有所增強(qiáng)。由以上表達(dá)情況可以看出，霜霉菌可以影響多數(shù)RGA基因的表達(dá)，經(jīng)霜霉菌誘導(dǎo)后表達(dá)相對(duì)含量增強(qiáng)的基因有 RGA1、RGA2、RGA4、RGA5、RGA8；而RGA10的相對(duì)表達(dá)量在霜霉菌誘導(dǎo)前后都比較高，初步認(rèn)為RGA10的表達(dá)不受霜霉菌的影響。

3 討 論

a.由以上表達(dá)情況可初步證明RGA是與黃瓜抗霜霉病有關(guān)的調(diào)控基因，RGA的表達(dá)情況和霜霉菌有密切的關(guān)系，這為以后進(jìn)行RGA基因全長(zhǎng)克隆以及黃瓜抗病性的研究奠定了基礎(chǔ)。

b.以穩(wěn)定表達(dá)的18S RNA基因作為對(duì)照[6]，用半定量的RT-PCR方法來檢測(cè)基因表達(dá)情況，并進(jìn)行定量分析。與傳統(tǒng)的檢驗(yàn)基因表達(dá)的Northern雜交相比較，具有特異性高，操作簡(jiǎn)單，可靠性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在植物基因的表達(dá)分析方面應(yīng)用廣泛。Wan等以微管蛋白基因作為對(duì)照，用半定量RTPCR方法研究小麥的鋅蛋白基因?qū)俳M成型表達(dá)基因[7]。王維平等則以水稻的肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閷?duì)照，用半定量RT-PCR方法，研究發(fā)現(xiàn)水稻COI1基因表達(dá)受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)[8]。

c.運(yùn)用半定量RT-PCR方法研究黃瓜RGA基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)需要注意以下幾點(diǎn)：① 總RNA和cDNA的質(zhì)量。只有在總RNA未被降解的情況下才能保證其中mRNA的完整性和隨后反轉(zhuǎn)錄的cDNA質(zhì)量，從而真實(shí)反映基因的表達(dá)。②總RNA的定量。在反轉(zhuǎn)錄之前，作為起始模板各個(gè)樣品中的總RNA質(zhì)量要一樣，cDNA量和電泳PCR產(chǎn)物量也要一樣，才能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能真實(shí)反映基因表達(dá)的實(shí)際情況。③PCR循環(huán)數(shù)的確定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量與循環(huán)數(shù)之間有一定線性關(guān)系。前期的擴(kuò)增產(chǎn)物的量隨循環(huán)數(shù)的遞增而成比例增加，隨著DNA聚合酶活性的下降和溶液中反應(yīng)底物的消耗，擴(kuò)增產(chǎn)物將達(dá)到一個(gè)平臺(tái)。半定量分析的循環(huán)數(shù)確定在成比例的線性關(guān)系范圍內(nèi)，表達(dá)豐度不同的基因半定量分析的PCR循環(huán)數(shù)不同。

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