劉立新，張羽男，沙靖全*，李 睿

（1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

柑桔屬蕓香科柑桔亞科，是熱帶、亞熱帶常綠果樹，用作經(jīng)濟栽培的有3個屬，枳屬、柑桔屬和金柑屬。

我國和世界其他國家栽培的柑桔主要是柑桔屬[1]。一直以來柑桔作為藥用植物深受中醫(yī)的青睞，桔皮理氣健脾，燥濕化痰；桔絡(luò)通絡(luò)理氣化痰；桔核理氣散結(jié)止痛；桔葉疏肝解郁，行氣散結(jié)，消腫化痰。但對其功效研究報道較少，柑桔中富含糖、酸、維生素C、礦物質(zhì)元素，還含有類黃酮、類胡蘿卜素、類檸檬苦素等活性物質(zhì)，其中類黃酮是柑桔中含量最為豐富、種類最多的一類功能活性成分。黃酮類化合物是一類以黃酮為母核的化合物，廣泛存在于植物界中，目前已發(fā)現(xiàn)有5 000多種植物中有黃酮類和異黃酮類物質(zhì)。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，具有高抗氧化性，低毒性，無不良反應(yīng)，同時還有顯著的清除人體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變等保健功能[2]，它是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。本文對柑桔皮中黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化作用進(jìn)行了研究，為利用柑桔皮工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類藥用成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取成熟的東莞小葉柑桔外皮，70℃烘干，粉碎，備用。

1.2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量為98%）（上海生化制劑廠）；硫代巴比妥酸（TBA）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙醇，石油醚，三氯甲烷等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

原料預(yù)先進(jìn)行石油醚脫脂、脫色素，以排除干擾。將柑桔皮粉用索氏提取法（石油醚為抽提劑，85℃水?。┟撝爸苄陨?，當(dāng)虹吸管中石油醚提取液無色時揮盡桔皮粉中石油醚，烘干，備用。

1.3.2 提取因素及其條件的確定

為全面考察乙醇提取法的工藝參數(shù)及最佳操作條件：確定以乙醇濃度、提取時間、固液比、提取溫度L9（34）進(jìn)行正交試驗設(shè)計，通過測定柑桔皮供試品中的總黃酮提取率，確定最佳提取工藝條件。試驗確定的因素水平見表1。

表1 試驗因素水平Table1 Factors and levels of experiment

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并加至刻度。分別精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mL 分置于50 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，再加10%硫酸鋁溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，加4%NaOH溶液20 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm的波長處測定吸光度。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得蘆丁溶液濃度（C）與吸光度值（A）關(guān)系曲線的回歸方程式：y=5.5045x+0.0053，r=0.9974。

1.3.4 提取物中黃酮類化合物含量的測定

分別取一定量的待測提取液，置于50 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，再加10%硫酸鋁溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，加4%NaOH溶液20 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，用紫外分光光度計，1 cm比色皿在350～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，在510 nm處有最大吸收，故在510 nm的波長處測定提取物的吸光度。

1.3.5 提取物的精制

采用萃取法對提取物進(jìn)行精制[3]。稱取柑桔皮粉40 g，在優(yōu)化的最佳提取工藝條件下進(jìn)行提取。然后將提取液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至1/3后將濾液在70℃水浴上蒸干，所得固體加入水20 mL溶解，再加入三氯甲烷20 mL，振搖，轉(zhuǎn)入分液漏斗，靜置，分層，棄去三氯甲烷層，水溶液再加入三氯甲烷20 mL重復(fù)1次，將水層減壓蒸餾，濃縮，再在水浴上蒸至近干，干燥，得精制品，備用。

1.3.6 TBA法測定柑桔皮黃酮抑制芝麻油的過氧化作用

先將柑桔皮黃酮用無水乙醇配置成濃度分別為0.20%、0.10%、0.05%的溶液，然后將配置好的黃酮溶液和蒸餾水各4 mL放入不同的具塞試管中，加入4.1 mL體積分?jǐn)?shù)為2.5%芝麻油，8 mL pH 7.5磷酸緩沖液和3.9 mL無離子水，混勻后置于40℃的培養(yǎng)箱中，每隔24 h取待測樣品1 mL，加入1 mL 20%的三氯乙酸，混勻，放置15 min后，加入2 mL 0.3%的TBA（用0.5%三氯乙酸配制），于沸水

式中，POV為樣品的過氧化值（mmol·kg-1）；

V1為試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；

V2為空白試驗消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；

M為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度（mol·L-1）；

m為樣品質(zhì)量（g）。浴中加熱15 min，取出室溫下冷卻后加入4 mL正丁醇，搖勻，于3 000 r·min-1離心15 min，取上層正丁醇液，于532 nm比色測定樣品的吸光度A值。

1.3.7 柑桔皮黃酮類化合物在豬油中的抗氧化作用

采用烘箱儲藏法測定提取物對豬油自氧化的抗氧化能力[4]。稱取粗黃酮粉0.01、0.05、0.20 g，各用4 mL無水乙醇溶解后分別加到20 g溫?zé)嶝i油中，攪勻，以不加桔皮黃酮粉，僅在20 g豬油中加入4 mL無水乙醇為對照樣，在70℃烘箱中強化保存，定時攪伴，于不同時間取樣測定豬油中的過氧化值（POV），并以此來表示豬油的氧化速度，進(jìn)而衡量柑桔皮黃酮類化合物的抗氧化活性。過氧化值的測定按滴定法進(jìn)行[5]。

樣品的過氧化值（POV）計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 提取柑桔皮黃酮類化合物的最佳工藝選擇

根據(jù)表1以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、固液比（C）、提取溫度（D）4個因素為影響因素，以黃酮類化合物提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table2 Result of orthogonal experiment

由表2可以看出，柑桔皮中黃酮類化合物的最佳提取工藝為A3B1C3D3，即乙醇濃度70%，提取時間1.5 h，固液比1：20，提取溫度80℃。乙醇濃度、提取時間、固液比、提取溫度4個因素對黃酮類化合物提取率影響的主次順序為：固液比>提取時間>乙醇濃度>提取溫度，且隨料液比和乙醇濃度的增加，提取率增加。經(jīng)驗證試驗得出該條件下提取出的黃酮類化合物為柑桔皮干重的2.689%。

2.2 柑桔皮類黃酮化合物抑制芝麻油的過氧化作用（硫代巴比妥酸法）

按照硫代巴比妥酸法測定的吸光度值如表3所示。

表3 不同濃度柑桔皮黃酮溶液與抗氧化性關(guān)系Table3 Relationship between different concentration of flavone of orange peel and antioxidation

TBA法是基于不飽和脂肪酸通過自由基反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化自由基，進(jìn)而氧化生成環(huán)氧化物，后者生成丙二醛，1分子的丙二醛可同2分子的TBA作用生成有色化合物，該有色化合物在530 nm左右有吸收峰[6]。由表3可以看出，添加桔子皮黃酮的溶液較不添加的對照樣吸光度值低，且添加不同濃度的柑桔皮黃酮溶液所測得的吸光度值不同，由此可以看出黃酮添加量大的抑制芝麻油的自動氧化時間長。

2.3 POV值測定法

不同濃度的黃酮溶液POV值隨時間變化情況如表4所示。

由表4和圖1可以看出，相對于對照樣，柑桔皮中提取的黃酮類化合物對豬油的自氧化有明顯的抑制作用，即桔皮黃酮粉添加到豬油后，POV值下降。并且隨添加量的增加，抗氧化能力也隨之增強，在試驗劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

表4 柑桔皮黃酮對豬油的抗氧化作用Table4 Antioxidation of flavone of orange peel to lard oil

圖1 不同桔皮黃酮添加量與抗氧化性關(guān)系Fig.1 Relationship between different addition of flavone from orange peel and antioxidation

3 討論

3.1 柑桔皮黃酮類化合物的提取工藝

黃酮類化合物在植物體內(nèi)以苷或苷元的形式存在。在大多數(shù)情況下，用有機溶劑可將苷或苷元全部提出，提取黃酮類化合物常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，但由于甲醇、丙酮等的毒性較大，因此一般采取乙醇為提取溶劑。李志洲研究了苦瓜中黃酮類化合物的乙醇提取工藝[7]，通過試驗確定最佳提取工藝條件為乙醇濃度90%，提取時間3 h，固液比1：60，提取溫度70℃，提取率可達(dá)7.128%。本研究以乙醇為溶劑從柑桔皮中提取黃酮類化合物，以固液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度為影響因素，黃酮類化合物的提取率為2.689%，比沙棗中、金橘皮中黃酮提取率要高。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)隨料液比的增加，提取效果越好，這是因為料液增加，浸出成分相應(yīng)增加，黃酮類化合物在大劑量的溶劑中始終成“稀”溶液的狀態(tài)，利于擴散的進(jìn)行；隨乙醇濃度的增加，提取率增加，說明黃酮類化合物醇溶性好；提取時間太短，黃酮類化合物不能完全浸出，但是時間過長可能會由于長時間在較高溫度下濃縮黃酮類成分遭到破壞，反而使提取率降低；提取溫度對黃酮提取率影響較小。

3.2 柑桔皮類黃酮化合物的抗氧化作用

廣泛存在于植物中的黃酮類化合物具有抗?jié)?、抗菌、抗炎、抗氧化、治療心腦血管疾病等藥用保健功能，是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑。崔永明等以POV為指標(biāo)[8]，采用烘箱法研究了甘草總黃酮對油脂的抗氧化性能。結(jié)果表明，甘草總黃酮對四種食用油脂（菜籽油、大豆油、花生油、豬油）均有良好的抗氧化效果，且對豬油具有較強的抗氧化作用，其作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系；楊建雄等用硫代巴比妥酸法研究柿葉黃酮的抗氧化效果[9]。結(jié)果表明，柿葉黃酮可以抑制·OH所致丙二醛的產(chǎn)生，減輕肝線粒體膨脹程度。本研究通過利用所提取的黃酮類化合物對芝麻油和豬油進(jìn)行抗氧化試驗，發(fā)現(xiàn)添加柑桔皮黃酮類化合物的芝麻油與TBA反應(yīng)后其吸光度降低，表明TBA染料生成得少，說明抗氧化作用抑制了自由基鏈反應(yīng)的進(jìn)行。在測定POV值試驗中添加黃酮粉后在開始階段，相對對照樣而言，各樣品的POV值皆下降，表現(xiàn)出明顯的降低豬油中過氧化值的作用，隨著時間的延長抗氧化性減弱，可能是由于長時間處于高溫下，黃酮類化合物的成分遭到破壞而造成的。柑桔皮類黃酮化合物之所以能表現(xiàn)出良好的抗氧化作用可能是因為黃酮類化合物具有多酚結(jié)構(gòu)，能夠提供活潑的氫質(zhì)子與油脂氧化產(chǎn)生的自由基結(jié)合成穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而阻止油脂的氧化反應(yīng)循環(huán)。

4 結(jié)論

柑桔皮中黃酮類化合物的含量較高，在乙醇濃度70%，提取時間1.5 h時，固液比1：20，提取溫度80℃的條件下提取的黃酮類化合物為柑桔皮干重的2.689%，比沙棗、金橘皮中黃酮類化合物含量高。柑桔皮黃酮類化合物能阻斷油脂的自氧化過程，具有良好的抗氧化作用的能力。可將其應(yīng)用于抗衰老，抗高血脂藥物研究中，進(jìn)一步開發(fā)其藥用價值。

[1]葉興乾.柑桔綜合加工利用[M].1版.北京:中國輕工業(yè)出版社,2005:13-25.

[2]孔琪,吳春.菊花黃酮的提取及抗氧化活性研究[J].中草藥,2004,35(9):1001-1002.

[3]陳乃富,張莉.蕨菜黃酮類化合物的提取與分析[J].中國林副特產(chǎn),2004(6):1-4.

[4]陳乃富.蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(11):63-66.

[5]趙新淮,張娜,王琳.油脂過氧化值的碘量測定法比較研究[J].中國油脂,2003,28(4):60-62.

[6]于晶,郝再彬,蒼晶,等.黃酮類化合物的活性研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(12):125-130.

[7]李志洲.苦瓜中黃酮類化合物的提取及抗氧化性研究[J].中國生化藥物雜志,2007,28(4):264-266.

[8]崔永明,余龍江.甘草總黃酮對油脂抗氧化作用研究[J].食品科學(xué),2007,28(11):119.

[9]楊建雄,原江鋒.柿葉黃酮的體外抗氧化作用研究[J].營養(yǎng)學(xué)報,2003,25(2):215.