杜智恒，楊春山，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖范圍的擴(kuò)大，北極狐已逐漸成為我國(guó)各地飼養(yǎng)場(chǎng)主要的飼養(yǎng)品種。為了增加我國(guó)北極狐的毛皮在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，各地飼養(yǎng)場(chǎng)不斷加強(qiáng)育種及進(jìn)行品種改良，并進(jìn)行了科學(xué)飼養(yǎng)，從芬蘭引進(jìn)了優(yōu)秀種狐同我國(guó)各飼養(yǎng)場(chǎng)的優(yōu)秀本地狐進(jìn)行雜交，以達(dá)到提高我國(guó)北極狐毛皮質(zhì)量的目的。但是我國(guó)狐的毛皮質(zhì)量與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，仍然有一定的差距。這就使得提高狐的毛皮質(zhì)量成為了人們研究的主攻方向，因此北極狐逐漸成為了研究的熱點(diǎn)，尤其在分子方面的研究也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

目前對(duì)北極狐基因的研究多集中于微衛(wèi)星方面的研究，而對(duì)一些核內(nèi)重要的功能基因及其它們的生物學(xué)功能的探索則相對(duì)較少，目前僅見(jiàn)Graphodatsky等通過(guò)G顯帶方法對(duì)北極狐、赤狐和狗的染色體圖譜進(jìn)行了比較研究[1]；胡曉航對(duì)銀狐的生長(zhǎng)激素（GH）基因的cDNA進(jìn)行了克隆測(cè)序的報(bào)道[2]。張敏等研究表明瘦素基因突變位點(diǎn)導(dǎo)致的基因型對(duì)北極狐的體重、腹圍和皮張長(zhǎng)度有極顯著的影響（P<0.01），而其受體基因突變位點(diǎn)導(dǎo)致的基因型對(duì)胴體重和針毛長(zhǎng)有極顯著的影響（P<0.01）[3]。本文主要對(duì)生長(zhǎng)激素（Growth Hormone，GH）基因進(jìn)行了SNPs檢測(cè)及與其生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析。

生長(zhǎng)激素（GH）是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素，其成熟肽由190～191個(gè)氨基酸殘基組成，不含糖基，分子質(zhì)量約為22 ku[4]。生長(zhǎng)激素基因由5或6個(gè)外顯子和4或5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成[5]。它是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素。能影響幾乎所有的組織類型和細(xì)胞，甚至包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)[6-7]，其主要作用是刺激骨、軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化；調(diào)理蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝。GH作用機(jī)理復(fù)雜，影響動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)、脂肪和糖的代謝，與其生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等密切相關(guān)。因此，GH已成為近些年在提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)性能等方面研究的熱點(diǎn)之一。哺乳動(dòng)物的GH基因研究得比較透徹，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成[8]。GH基因的研究首先是從大鼠和人開(kāi)始的，隨后在牛、羊、豬、貓、狗、大熊貓、豚鼠以及禽類的雞、鴨、鵝、還有魚(yú)類等動(dòng)物中相繼展開(kāi)了研究。

例如，聶慶華等以粵黃雞矮腳黃系等不同蛋雞、肉雞品種（系）作為試驗(yàn)材料研究GH基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)肉雞、速生型肉雞內(nèi)含子1和4的等位基因的基因型頻率和基因頻率比較接近，而蛋雞與它們的差別比較明顯[9]。孫少華等做了關(guān)于肉牛生長(zhǎng)激素基因與主要生產(chǎn)性能的研究，該研究是為了尋找主要生產(chǎn)性能（12月齡體重、6～12月齡日增重）與基因型效應(yīng)的關(guān)系，以便進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，達(dá)到肉牛良種早選、選準(zhǔn)、提高肉牛生產(chǎn)性能的目的，并取得了初步的進(jìn)展[10]。Ferraz等在對(duì)牛的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行多態(tài)性研究中在其5'側(cè)翼序列共找到了6個(gè)新的SNPs[11]，這些SNPs將有助于對(duì)牛開(kāi)展進(jìn)一步的分子標(biāo)記研究。說(shuō)明該基因具有重要的研究?jī)r(jià)值。

目前對(duì)于狐貍生長(zhǎng)激素基因方面的報(bào)道很少，尚未見(jiàn)有關(guān)北極狐生長(zhǎng)激素基因方面的相關(guān)報(bào)道，在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中我們只檢索到了銀狐的GH基因cDNA序列，本實(shí)驗(yàn)也是根據(jù)該序列與UCSC上的狗的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)后設(shè)計(jì)的引物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大興安嶺圖強(qiáng)林業(yè)局狐貉養(yǎng)殖基地提供一年生北極狐，首先將5 mL的EP管事先裝入75%的酒精，當(dāng)狐場(chǎng)殺狐取皮的時(shí)候，用剪刀剪取死狐的腿部肌肉裝入管中，置于-20℃冰箱中保存。另外，對(duì)已上楦板的狐皮進(jìn)行采樣時(shí)，則是從其左后爪上剪下一點(diǎn)皮毛裝入1號(hào)封口袋內(nèi)。

其中有296個(gè)個(gè)體均有處死時(shí)的體重、體長(zhǎng)和腹圍記錄，但沒(méi)有皮張長(zhǎng)度記錄；另外，選取412個(gè)個(gè)體，這些個(gè)體只有剝皮后的皮張長(zhǎng)度記錄。采樣記錄詳見(jiàn)表1，部分樣品詳細(xì)記錄見(jiàn)表2、3。

表2 試驗(yàn)樣品體重、體長(zhǎng)及腹圍記錄Table2 Records of sample weight,body length and abdominal circumference

表3 試驗(yàn)樣品皮張長(zhǎng)度記錄Table3 Records of sample furriery length

1.2 DNA提取和檢測(cè)

北極狐基因組DNA按SDS法提取，并溶于TE中，－20℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法雙重檢測(cè)DNA的純度和濃度，然后稀釋成 50 ng·μL-1備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上北極狐（Accession No.EU159 584）GH基因的cDNA序列和Ucsc上狗的全基因組進(jìn)行Blast比對(duì)，找到5個(gè)外顯子序列，根據(jù)這5個(gè)外顯子序列共設(shè)計(jì)了6對(duì)引物。另外，根據(jù)內(nèi)含子2又設(shè)計(jì)了4對(duì)引物。引物序列見(jiàn)表4。

表4 GH基因PCR-SSCP的引物序列、產(chǎn)物大小及位置Table4 Primer sequences，corresponding PCR product size and position for GH PCR-SSCP

1.4 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)物組成：共25 μL體系，其中包括：滅菌去離子水 16.3 μL，50 ng·μL-1的 DNA 模板 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1的 dNTP 2.0 μL，10 pmol·μL-1的上下游引物各 1 μL，0.5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶 0.2 μL。

由于特異性引物的TM值和GC含量的差異，因此每對(duì)引物復(fù)性的溫度有所不同。各引物的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)均為：94℃預(yù)變性7 min；之后35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，50～60℃復(fù)性40 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸10 min。

1.5 PCR-SSCP檢測(cè)多態(tài)

在16%的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳條件下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)模型與分析

根據(jù)本研究試驗(yàn)群體的特點(diǎn)，構(gòu)建如下線性回歸模型：

模型 1：y＝μ+G+S+G*S+e

模型 2：y＝μ+G+e

y為性狀觀察值，μ為群體均數(shù)，G為基因型固定效應(yīng)，S為性別觀察值，G*S為基因型與性別的互作效應(yīng)，e為隨機(jī)效應(yīng)。對(duì)于模型1使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP7.0檢驗(yàn)基因型與公母狐整個(gè)群體性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值；對(duì)于模型2使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP7.0分別檢驗(yàn)基因型與公母狐群體性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物Gh2的多態(tài)性分析結(jié)果

2.1.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

針對(duì)該基因我們共設(shè)計(jì)了10對(duì)引物進(jìn)行PCR-SSCP檢測(cè)，以北極狐的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各對(duì)引物特異性擴(kuò)增良好，片段長(zhǎng)度均與預(yù)期的片段大小一致，經(jīng)過(guò)在不同濃度聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳條件下進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明只在Gh2、IGH2和IGH4這3對(duì)引物中檢測(cè)到了多態(tài)，其余7對(duì)引物均沒(méi)有檢測(cè)到多態(tài)。

引物Gh2以北極狐的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度與預(yù)期的片段大小一致（158 bp左右）（見(jiàn)圖1），可以用來(lái)進(jìn)行SSCP分析。

2.1.2 SSCP檢測(cè)結(jié)果

在16%的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳條件下進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明，在不同個(gè)體中檢測(cè)到了3種基因型，分別命名為AA型、BB型和AB型（見(jiàn)圖2）。分別取兩個(gè)AA型和兩個(gè)BB型個(gè)體進(jìn)行回收克隆測(cè)序，通過(guò)測(cè)序結(jié)果同源性比較發(fā)現(xiàn)，在該序列的第81位點(diǎn)處發(fā)生了（G-A）轉(zhuǎn)換，將與GenBank中序列（Accession Number.EU159584）一致的純合子命名為BB型，另外一種純合子定義為AA型（見(jiàn)圖3）。通過(guò)序列分析表明，該點(diǎn)突變并沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸上的變化，屬于同義突變。

2.2 引物IGH2的多態(tài)性分析結(jié)果

2.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

引物IGH2以北極狐的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性擴(kuò)增良好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期的片段大小一致（180 bp左右）（見(jiàn)圖4），可以用來(lái)進(jìn)行SSCP分析。

2.2.2 SSCP檢測(cè)結(jié)果

將引物CGH2所測(cè)4個(gè)個(gè)體的序列用DNAMAN進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，在186位點(diǎn)和239位點(diǎn)處分別發(fā)生了（C-T）和（T-C）轉(zhuǎn)換，引物IGH2正是針對(duì)這兩個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的。在16%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳條件下進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明，在不同個(gè)體中檢測(cè)到了5種基因型（見(jiàn)圖5），分別命名為CC型、DD型、EE型、CD型和CE型。我們將與GenBank中序列（EU376045）一致的純合子命名為CC型，另兩種純合子分別命名為DD型和EE型（見(jiàn)圖6）。但是由于DD型與DE型可能存在區(qū)分不開(kāi)的問(wèn)題，所以在接下來(lái)的統(tǒng)計(jì)中，我們僅針對(duì)C186T這個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致的CC、EE和CE這三種基因型進(jìn)行分析。

2.3 引物IGH4的多態(tài)性分析結(jié)果

2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)GenBank上北極狐（Alopex lagopus）GH基因的DNA序列（EU376045），在其第二內(nèi)含子和第三外顯子上設(shè)計(jì)引物IGH4，以北極狐的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性擴(kuò)增良好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期的片段大小一致（169 bp左右）（見(jiàn)圖7），可以用來(lái)進(jìn)行SSCP分析。

2.3.2 SSCP檢測(cè)結(jié)果

將引物CGH2所測(cè)四個(gè)個(gè)體的序列用DNAMAN進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，在583位點(diǎn)處分別發(fā)生了（C-A）顛換，引物IGH4正是針對(duì)這個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的。在16%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳條件下進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明，在不同個(gè)體中檢測(cè)到了3種基因型（見(jiàn)圖8），分別命名為FF型、GG型和FG型。我們將與GenBank中序列（EU376045）一致的純合子命名為FF型，另一種命名為GG型（見(jiàn)圖9）。通過(guò)序列分析表明，該點(diǎn)突變沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸變化，屬于同義突變。

2.4 GH基因多態(tài)性與北極狐生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析

2.4.1 GH基因多態(tài)性與北極狐整個(gè)群體生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析

以大興安嶺圖強(qiáng)林業(yè)局養(yǎng)狐場(chǎng)的北極狐為試驗(yàn)群體，對(duì)GH基因的多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行最小二乘分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GH基因不同區(qū)域的SNPs對(duì)北極狐的生長(zhǎng)性狀有一定的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。其中第2外顯子的G81A突變位點(diǎn)（Accession Number.EU159584）對(duì)北極狐的皮張長(zhǎng)度性狀有一定的影響趨勢(shì)（P<0.2）；第3外顯子的C583A突變位點(diǎn)對(duì)北極狐的體重、體長(zhǎng)、腹圍和皮張長(zhǎng)度性狀均有一定的影響趨勢(shì)（P<0.2）。

2.4.2 GH基因多態(tài)性分別與公母狐生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析

以大興安嶺圖強(qiáng)林業(yè)局養(yǎng)狐場(chǎng)的北極狐為試驗(yàn)群體，對(duì)GH基因的多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行最小二乘分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GH基因不同區(qū)域的SNPs對(duì)公母北極狐的生長(zhǎng)性狀有一定的影響，見(jiàn)表6。其中第3外顯子的C583A突變位點(diǎn)對(duì)公狐的體重性狀和皮張長(zhǎng)度性狀均有一定的影響趨勢(shì)（P<0.2），而對(duì)公狐的體長(zhǎng)性狀則影響顯著（P<0.05）。

表5 GH基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)北極狐生長(zhǎng)性狀的影響（P值）Table5 Effects of GH gene polymorphisms on arctic fox growth traits(P value)

表6 GH基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響（P值）Table6 Effects of GH gene polymorphisms on growth traits(P value)

GH基因（外顯子3）C583A突變與公狐體長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析，公狐FF、FG、GG基因型個(gè)體間體長(zhǎng)性狀的多重比較結(jié)果表明，F(xiàn)G基因型個(gè)體體長(zhǎng)顯著大于FF基因型個(gè)體（見(jiàn)表7）。

表7 C583A突變對(duì)公狐體長(zhǎng)的影響（最小二乘均值）Table7 Effects of different genotypes of C583A mutant on male fox body length(LSM)

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)激素作用機(jī)理復(fù)雜，影響動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)、脂肪和糖的代謝，與其生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等密切相關(guān)。因此，GH是近些年在提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)性能等方面研究的熱點(diǎn)之一。另外，對(duì)QTL的檢測(cè)和利用是實(shí)現(xiàn)從分子水平上對(duì)控制畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的基因進(jìn)行操縱的關(guān)鍵。在尋找畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的連鎖標(biāo)記的過(guò)程中，候選基因法是一種非常有效的方法，它不僅能夠?qū)ふ业侥切┡c性狀相連鎖的間接標(biāo)記（Indirect Marker），而且還有可能尋找到影響性狀的直接標(biāo)記（Direct Marker），即控制該性狀的基因[12]。Malveiro等發(fā)現(xiàn)，Algarvria山羊5個(gè)外顯子上均存在單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP），且3個(gè)外顯子多態(tài)性與奶山羊產(chǎn)奶量、脂肪量和乳蛋白量顯著相關(guān)[13]。NTE等研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素基因?qū)﹄u的生長(zhǎng)和屠體性狀均有影響[14]。胡沈榮等對(duì)5個(gè)山羊品種的GH基因的第2、5外顯子的多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)山羊GH基因外顯子5位點(diǎn)頻率分布與品種特性顯著相關(guān)，且該區(qū)域?qū)Ξa(chǎn)奶量有顯著影響。同時(shí)，外顯子2區(qū)域?qū)Ξa(chǎn)羔數(shù)有顯著影響[15]。俞沛初等對(duì)大約克夏豬、上海白豬、巴馬香豬三個(gè)豬種生長(zhǎng)激素基因的多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了可能是小型豬的有利基因型[16]。綜合以上這些結(jié)果可以認(rèn)為，GH對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用。

本研究首先依據(jù)GH基因在畜禽生長(zhǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵作用，將GH基因確定為可能影響北極狐生長(zhǎng)性狀的候選基因。然后在大興安嶺圖強(qiáng)林業(yè)局北極狐群體中研究了GH基因三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)整個(gè)群體生長(zhǎng)性狀的影響和這三個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性分別對(duì)公母狐群體生長(zhǎng)性狀的影響。檢測(cè)結(jié)果表明，北極狐GH基因第2外顯子的G81A突變位點(diǎn)（Accession number.EU159584）對(duì)整個(gè)群體的皮張長(zhǎng)度性狀有一定的影響趨勢(shì)（P<0.2）；但針對(duì)該點(diǎn)分別對(duì)公母狐進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該突變位點(diǎn)導(dǎo)致的三種基因型對(duì)公母狐的皮張長(zhǎng)度性狀均沒(méi)有影響。說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)北極狐皮張長(zhǎng)度性狀具有一定的影響，但這種影響在性別上沒(méi)有偏向性。同時(shí)，該基因第3外顯子的C583A突變位點(diǎn)對(duì)整個(gè)群體的體重、體長(zhǎng)、腹圍和皮張長(zhǎng)度性狀均有一定的影響趨勢(shì)（P<0.2）。而且在公母狐群體中對(duì)該點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，此突變導(dǎo)致的FF、FG、GG三種基因型對(duì)公狐體長(zhǎng)性狀有顯著影響（P<0.05）。說(shuō)明就體長(zhǎng)性狀來(lái)說(shuō)，該點(diǎn)在公狐群體中發(fā)揮的作用要大于在母狐群體的作用?？梢詰?yīng)用該標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)公狐的體長(zhǎng)性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，這將有助于加速北極狐的分子育種進(jìn)程。

在統(tǒng)計(jì)學(xué)中，常常需要定義顯著水平。顯著水平的大小要依據(jù)具體的試驗(yàn)而定。在生物學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)中，通常把0.05定義為顯著水平。但有時(shí)在對(duì)試驗(yàn)要求不太嚴(yán)格或難以獲得較大樣本等情況時(shí)，可以將這一標(biāo)準(zhǔn)放寬。如我們?cè)趯?duì)候選基因與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析的研究中，常常把小概率P<0.05定義為因素對(duì)指標(biāo)有顯著影響，而把P<0.2定義為有影響，這樣做的目的是盡可能避免把那些實(shí)際上對(duì)目標(biāo)性狀有顯著影響而一次試驗(yàn)未能達(dá)到P<0.05顯著的基因錯(cuò)誤的排除掉。如在Li等的論文中就是如此[17]。

從以上分析結(jié)果可以看出，GH基因可能是影響北極狐體長(zhǎng)性狀的主效基因或與影響該性狀的主效基因緊密連鎖。

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