李 翠 翠, 莊 子 瑜, 劉 廷 強, 魚 紅 閃, 金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學 生物與食品工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參皂苷是人參的標志性活性成分之一，已鑒定結構的人參皂苷有60多種。人參皂苷的生理活性,決定了它的食用和藥用價值[1]。人參口服之后，其皂苷糖基被腸道菌和消化系統(tǒng)的酶水解成低糖基的皂苷，吸收起藥效[2]，如Rb1口服后轉化為人參稀有皂苷C-K。但是這種體內的轉化受到個體各種因素的約束，轉化微量。為了在體外得到高活性的人參稀有皂苷，本實驗室研究了人參皂苷糖苷酶，張春枝等[3-4]研究了人參植物莖葉的人參皂苷糖苷酶；魚紅閃等[5]發(fā)現(xiàn)了Aspergillussp.g48p來源的一種人參皂苷糖苷酶，該酶能水解人參皂苷Rb1、Rb2和Rc的第3碳上的β-葡萄糖苷基，也能水解Rb1第20碳上的β-葡萄糖苷基、Rb2第20碳上的α-吡喃阿拉伯糖苷基和Rc的第20碳上的α-呋喃阿拉伯糖苷基，生成稀有人參皂苷C-K，定名為人參皂苷糖苷酶I型。本文主要研究真菌sp.g848p發(fā)酵所產生的人參皂苷糖苷酶的分離提純、酶的特性以及將人參二醇類皂苷轉化為人參皂苷C-K的酶反應。

1 材料與方法

1.1 材 料

人參皂苷標準品C-K、PPD皂苷(人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的混合物)；薄層層析板Silica Gel 60-F254；DEAE-Cellulose離子交換樹脂；標準蛋白。

1.2 方 法

1.2.1 微生物培養(yǎng)產酶

菌種為真菌 sp.g848，大曲中篩選。

將4%的麥芽汁中加入相當于1%的人參提取物,加熱滅菌,冷卻接菌，在28 ℃通風攪拌培養(yǎng)4～6 d；冷凍離心除菌，收集上清液，向上清液中徐徐攪拌加入70%飽和度的硫酸銨、在4 ℃過夜、離心收集沉淀，用少量緩沖液溶解沉淀，在0.02 mol/L pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液中透析除鹽，再一次離心得上清，用上述緩沖液定容至1/10體積的發(fā)酵液，即為粗酶液。

1.2.2 皂苷糖苷酶提純

酶的提純是通過DEAE-Cellulose離子交換柱分離，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、切割單帶的方法。向預處理過的DEAE-Cellulose離子交換柱中緩慢加入8 mL粗酶液，分別用0.02 mol/L pH 5.0 NaAc-HAc 緩沖液、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L KCl溶液各50 mL進行梯度洗脫，測定紫外吸光值，分離提純酶蛋白。選取紫外吸光值(OD值)較高的試管，從中取出0.1 mL酶液，以0.1 mL 的0.5%人參皂苷PPD為底物，進行酶反應，TLC檢測，并觀察結果。對DEAE-Cellulose離子交換柱分離純化后的具有皂苷糖苷酶活力的餾分，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳法進一步純化。將在凝膠上形成單帶的酶蛋白切割后，溶于0.02 mol/L pH 5.0 NaAc-HAc緩沖液；充分溶解后，經高速冷凍離心，除去不溶性沉淀，所得上清液為進一步純化的皂苷糖苷酶，用于酶性質的研究和酶蛋白分子質量的測定。

1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白分子質量

實驗采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提純皂苷糖苷酶并測定分子質量。濃縮膠質量分數(shù)為5%，工作電壓為30 V；分離膠質量分數(shù)為12%，工作電壓為60 V。電泳約2 h，考馬氏亮藍染色。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中使用的標準蛋白是混合蛋白質包括：phosphorylase-b (97.2 ku),albumin (66.4 ku)，ovalbumin (44.3 ku)，carbonic anhydrase (29.0 ku)，trypsin- inhibitor(20.1 ku)，α-lactalbumin (14.3 ku)。

1.2.4 薄層層析法

微量點樣，展開劑V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5，H2SO4水溶液顯色，分析酶活，確定最適的酶反應條件[6]。

1.2.5 最適酶反應條件的研究

以人參二醇類皂苷PPD為底物，取0.02 mL 0.5%的PPD與等體積酶液反應，分別在12、18、24、30、36、48、72 h取樣，測定酶活力。在最適反應時間的基礎上，取等體積pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的底物溶液與酶液混合，在40 ℃反應24 h，測定酶活力。在酶水解最適反應時間、最適pH基礎上，取等體積底物溶液與酶液混合，分別在30、35、40、45、50、55、60 ℃下反應24 h，測定酶活力。

2 結果與討論

2.1 酶的純化

2.1.1 DEAE-Cellulose 離子交換柱分離提純皂苷糖苷酶

采用自動部分收集器收集洗脫液，每3 min收集1管，每管收集3 mL，紫外分光光度計在280 nm測定各管OD值，最后選取OD值較高的試管進行下一步試驗，所得OD值如圖1所示。

圖1 分離的各梯度酶的紫外吸光值Fig.1 The OD of purify enzyme

根據(jù)圖1所示各梯度紫外吸光值，選取峰值管，即1、21、34、36、39、41、42、59、75、78、90、92、107管的洗脫液，進行酶反應，反應后用TLC法檢測酶的活力，結果如圖2所示。

C-K，標準品；1、21、34、36、39、41、42、59、75、78、90、92、107，分離的酶液管號

由圖2可知，其中39、41、42、59號管均能將人參二醇類皂苷PPD轉化為人參皂苷C-K，但只有41、42號管轉化的效果最好。

2.1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳純化皂苷糖苷酶

經DEAE-Cellulose 離子交換柱分離純化后的具有酶活力的酶蛋白——39、41、42、59號管酶，采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳法進一步純化。只有41、42號管在聚丙烯酰胺凝膠上形成單帶,即酶的純度較高。但是為了進一步純化酶，將單帶的酶蛋白對照未染色的凝膠切割，充分溶解后，經高速冷凍離心，除去不溶性沉淀，所得上清液為進一步純化的皂苷糖苷酶，用于酶蛋白分子質量的測定。

2.2 皂苷糖苷酶的分子質量的測定

將經過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化的皂苷糖苷酶進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，同時使用標準蛋白。電泳約2 h，考馬氏亮藍染色，結果如圖3所示。

41、42，酶液的管號

根據(jù)圖3測量標準蛋白的遷移率，作出標準曲線如圖4所示。圖4中橫坐標為相對遷移率，縱坐標為蛋白質的分子質量，所得的標準曲線回歸方程是lgY=-1.115 5X+2.027 6。

圖4 標準曲線Fig.4 The standard curve

根據(jù)電泳圖測量41、42管的遷移率為0.24，帶入回歸方程中計算得該酶的分子質量為74.0 ku。

2.3 提純酶的研究

2.3.1 pH對酶的影響

以0.5%的人參二醇類皂苷PPD為底物，與等體積的純酶液混合，40 ℃反應24 h，TLC檢測如圖5所示。

圖5 pH對酶反應的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme reaction

pH為5.0時，底物PPD中Rb1、Rb2、Rc基本能全部轉化，即人參二醇類皂苷PPD水解的量最大，生成的人參皂苷C-K最多，因此pH 5.0時酶的活性最好。

2.3.2 溫度對酶反應的影響

以0.5%人參二醇類皂苷PPD為底物，與等體積純酶液混合，pH 5.0，分別在30、35、40、45、50、55、60 ℃反應24 h，檢測酶活如圖6所示。

圖6 溫度對酶反應的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme reaction

根據(jù)圖6所示，50 ℃時酶反應最徹底，底物PPD中Rb1、Rb2、Rc基本能全部轉化，但是酶在50 ℃時不穩(wěn)定，酶在45 ℃時，轉化人參皂苷PPD生成人參皂苷C-K的量僅次于50 ℃，所以最適的酶反應溫度定為45 ℃。

2.3.3 時間對酶反應的影響

以0.5%人參二醇類皂苷PPD為底物，與等體積純酶液混合，pH 5.0、45 ℃反應，分別在12、18、24、30、36、48、72 h取樣，酶活力如圖7所示。

圖7 反應時間對酶反應的影響Fig.7 Effect of time on enzyme reaction

由圖7可見，酶反應24 h時，底物人參二醇類皂苷PPD水解轉化量最大，即產物人參皂苷C-K生成量最大，因此最適酶反應時間為24 h。

3 結 論

真菌sp.g848p發(fā)酵產生的把人參二醇類皂苷PPD轉化為人參皂苷C-K的酶是一種特異的人參皂苷糖苷酶。該酶能水解人參二醇類皂苷PPD中Rb1、Rb2和Rc的第3碳上的β-葡萄糖苷基，該酶經DEAE-Cellulose離子交換柱,分離得到具有轉化人參二醇類皂苷PPD酶活力的水解酶，進一步通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到純酶。該酶分子質量約為74.0 ku,最適反應時間為24 h，最適反應溫度為45 ℃、最適pH為5.0。

[1] LI T S C, MAZZA G, COTTRELL A C, et al. Gisenosides in roots and leaves of American ginseng[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1996, 44(3):717-720.

[2] KOHDA H, TANAKA O. Enzymic hydrolysis of ginseng saponins and their related glycosides[J]. Yakugaku Zasshi, 1975, 95(2):246-249.

[3] ZHANG Chunzhi, LI Dai, YU Hongshan, et al. Purification and characterization of picied-β-glucosidase fromAspergillusniger[J]. Process Biochemistry, 2007, 42:83-88.

[4] ZHANG Chunzhi, YU Hongshan, BAO Yongming, et al. Purification and characterization of ginsenoside-β-glucosidase from ginseng[J]. Chemical Pharmmacelltical Bulletin, 2001, 49(7):795-798.

[5] YU Hongshan, ZHANG Chunzhi, LU Mingchun, et al. Purification and characterization of new special ginsenosidase hydrolyzing multi-glycisides of protopanaxadiol ginsenosides, ginsenosidase type I[J]. Chemical Pharmmacelltical Bulletin, 2007, 55(2):231-235.

[6] YU Hongshan, GONG Jinmei, ZHANG Chunzhi, et al. Purification and characterization of ginsenoside -α-rhamnosidase[J]. Chemical Pharmmacelltical Bulletin, 2002, 50(2):175-178.