響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌lp15-2-1產(chǎn)共軛亞油酸發(fā)酵條件

周 倩，劉 佩，馬鎏镠，阮 暉，何國慶*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌lp15-2-1產(chǎn)共軛亞油酸發(fā)酵條件

周 倩，劉 佩，馬鎏镠，阮 暉，何國慶*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

對植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸(CLA)發(fā)酵工藝進行研究。通過單因素試驗確定最佳接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時間、亞油酸添加時間、亞油酸質(zhì)量濃度。采用響應(yīng)面Box-Benhnken試驗設(shè)計，建立初始pH值、培養(yǎng)溫度和亞油酸質(zhì)量濃度的二次多項式回歸方程模型，所得植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)共軛亞油酸的最佳參數(shù)為：溫度30℃、亞油酸質(zhì)量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3，此條件下，CLA得率為44.77μg/mL，CLA理論得率為45.326μg/mL，轉(zhuǎn)化率為21.32%，與優(yōu)化前轉(zhuǎn)化率7.78%相比，有了很大提高。

共軛亞油酸；植物乳桿菌；響應(yīng)面法

Abstract：In this work, the fermentation conditions for converting linoleic acid into conjugated linoleic acid (CLA) byLactobacillus plantarumlp15-2-1 were studied. Single factor experiments were done to understand the effects of inoculum amount,incubation temperature, pH, incubation time and initial level of linoleic acid on CLA production. Using response surface Box-Benhnken design, a quadratic polynomial regression model was established. The results indicated that the optimal levels of incubation temperature, initial level of linoleic acid and pH were30 ℃, 0.21 mg/mL and 6.3, respectively. Under these optimal fermentation conditions, the yield and conversion rate of CLA were 44.77μg/mL and 21.32 %, which were higher than the predicted values of 45.326 μg/mL and 7.78 %, respectively.

Key words：conjugated linoleic acid (CLA)；Lactobacillus plantarum；response surface methodology

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一系列含有共軛雙鍵、具有位置和構(gòu)象異構(gòu)的十八碳二烯酸的總稱，是必需脂肪酸亞油酸(linoleic acid，LA)的一組異構(gòu)體。人類和動物中最主要的異構(gòu)體是順-9,反-11-十八碳二烯酸(c9,t11-CLA)[1-2]，被命名為瘤胃酸(rumenic acid)。研究表明，CLA具有抗氧化、抗癌、抗動脈粥樣硬化、減少機體脂等功能[3-5]。

目前商業(yè)化生產(chǎn)CLA主要是以富含LA的種子油(如向日葵油(64% LA)、玉米油(57% LA)、棉籽油(53%LA)、豆油(51% LA)等)進行堿催化異構(gòu)。其機理是：在強堿條件下，LA第11位碳被奪去一個質(zhì)子，形成碳負(fù)離子，然后由于熱力學(xué)因素引起碳負(fù)離子遷移，從而形成不同的共軛化產(chǎn)物[6-7]。采用化學(xué)方法原理比較簡單，但在反應(yīng)過程中會產(chǎn)生一系列CLA異構(gòu)體混合物、飽和或不飽和脂肪酸及有毒物質(zhì)，活性CLA提純工藝繁瑣，應(yīng)用成本較高。

已發(fā)現(xiàn)一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌能生物合成CLA。微生物合成CLA在培養(yǎng)方面靈活、不需要高溫高壓；生成的異構(gòu)體以c9,t11-CLA為主，分離純化步驟相對簡單。但是，瘤胃菌是嚴(yán)格厭氧菌，培養(yǎng)困難，且發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜，發(fā)酵條件難以控制。而乳酸菌是人體益生菌，可以兼性發(fā)酵或微含氧發(fā)酵，發(fā)酵成本低廉，發(fā)酵條件易控制，且發(fā)酵產(chǎn)物對人體安全，用其生產(chǎn)CLA可以直接應(yīng)用于食品，或精制成藥品，因此應(yīng)用乳酸菌生產(chǎn)CLA將有廣闊的應(yīng)用前景[8-10]。

本實驗采用從泡菜中分離篩選，并經(jīng)過誘變處理后獲得的一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1。利用單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵條件，為實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1由實驗室分離篩選。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、無水乙酸鈉5.0g、檸檬酸三胺2.0g、Tween-801.0mL、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.02g、硫酸錳0.05g、蒸餾水1.0L，pH6.0～6.5。配好的培養(yǎng)液分裝至10mL厭氧管中。121℃滅菌20min。

1.2 試劑與儀器

亞油酸(LA)、共軛亞油酸(CLA) Sigma公司。

雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-9V型酸度計 杭州華光無線電廠；L-550臺式低速大容量離心機 長沙湘儀離心機有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

菌種活化：取保存在4℃冰箱的植物乳桿菌活化兩次后，接種至裝有10mL MRS培養(yǎng)液的厭氧管(15mm×160mm)中，振蕩或靜止培養(yǎng)。

亞油酸的乳化：配制體積分?jǐn)?shù)1%吐溫-80溶液，121℃、20min滅菌。滅菌后加入適量LA，混勻，冰水浴下超聲波乳化分散(功率600W，工作5s，間歇10s，20次)；之后用0.22μm無菌濾膜過濾[11]。

1.3.1 單因素試驗

考察氮氣排氧(采用氮氣驅(qū)除氧氣和未驅(qū)除氧氣的比較)、振蕩培養(yǎng)(180r/min振蕩和靜止培養(yǎng)的比較)、LA質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)、接種量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%)、培養(yǎng)溫度(25、30、33、37、42℃)、初始pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、培養(yǎng)時間(0、12、24、36、48、60、72h)、LA添加時間(接種0、2、4、6、8、10、12h后，再加入LA)對CLA生成的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用軟件Design-Expert 6.0中的Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以溫度、LA質(zhì)量濃度、pH值3個因素為自變量，以CLA得率為響應(yīng)值設(shè)計試驗。

表1 Box-Benhnken試驗設(shè)計因素和水平Table 1 Factors and levels in the Box-Benhnken experiment design

1.3.3 測定方法

共軛亞油酸在波長233nm處有明顯吸收峰，利用共軛亞油酸的這一特性，采用紫外分光光度法進行檢測。以正己烷為溶劑，將CLA標(biāo)樣配成不同質(zhì)量濃度的溶液，以正己烷為參比，測定233nm波長處的吸光度，以CLA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.1058x+0.1452，R2=0.9918。

樣品處理：用等體積的正己烷、異丙醇萃取發(fā)酵液，振蕩混勻后，離心；再水洗、離心。于233 nm波長處測定吸光度，空白對照為同條件培養(yǎng)的MRS(添加同質(zhì)量濃度LA)培養(yǎng)液的正己烷提取液[12-13]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到CLA質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量的影響

圖1 接種量對CLA得率的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on the yield of CLA

如圖1所示，接種量為1%時，CLA得率達到最大值；接種量從1%～2%，CLA得率緩慢降低；接種量從2%～4.5%，CLA得率變化較小，趨于直線?？赡苡捎谠诎l(fā)酵液體積相等的情況下，菌體可利用的營養(yǎng)物質(zhì)有限，而菌體生長速度較快，在較短時間內(nèi)即可達到最大值。

2.1.2 N2排氧的影響

圖2 N2排氧對CLA得率的影響Fig.2 Effect of oxygen amount on the yield of CLA

如圖2所示，用高純氮氣驅(qū)除培養(yǎng)液中的氧氣，造成微氧環(huán)境對生成CLA有利。微氧條件可以防止發(fā)酵液中的LA和CLA被氧化，減少因氧化造成的底物和產(chǎn)物損失。

2.1.3 振蕩培養(yǎng)的影響

圖3 振蕩培養(yǎng)對CLA得率的影響Fig.3 Effect of shaking on the yield of CLA

如圖3所示，振蕩培養(yǎng)時，CLA得率較靜止培養(yǎng)高。振蕩過程中，底物L(fēng)A在培養(yǎng)液中分散地更均勻，有利于營養(yǎng)物質(zhì)和LA進入菌體細胞內(nèi)部。

2.1.4 培養(yǎng)溫度的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對CLA得率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of CLA

如圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度從25℃升高至30℃時，發(fā)酵液中CLA得率逐漸增大；到30℃時，達到最大值；隨著溫度的繼續(xù)升高，CLA生成受到抑制，得率逐漸降低?？梢?，較低或較高溫度均不利于CLA的生成。

2.1.5 培養(yǎng)時間的影響

圖5 培養(yǎng)時間對CLA得率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the yield of CLA

如圖5所示，0～24h內(nèi)發(fā)酵液中的CLA含量迅速增加；24～48h內(nèi)CLA得率增加放緩，48h達到最大值；48h后CLA得率又逐漸降低，呈下降趨勢。

2.1.6 培養(yǎng)基初始pH值的影響

圖6 培養(yǎng)基初始pH值對CLA得率的影響Fig.6 Effect of initial pH on the yield of CLA

如圖6所示，pH值在5.5～7.0范圍內(nèi)，CLA得率較高，6.0時達到最大值；pH值在4.0、4.5、8.5～10.0范圍內(nèi)，基本不能合成CLA。pH值對CLA得率的影響很大，可能是因為pH值在CLA共軛雙鍵的形成過程中對質(zhì)子傳遞過程起決定作用。

2.1.7 LA質(zhì)量濃度的影響

圖7 LA質(zhì)量濃度對CLA得率的影響Fig.7 Effect of initial level of linoleic acid on the yield of CLA

如圖7所示，隨著LA質(zhì)量濃度的增大，CLA得率逐漸增大，CLA轉(zhuǎn)化率逐漸降低。當(dāng)LA質(zhì)量濃度為1.0mg/mL時，CLA得率達到72.24μg/mL，而轉(zhuǎn)化率較低；LA質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時，轉(zhuǎn)化率最大，達到24.34%。綜合考慮CLA得率和轉(zhuǎn)化率，選取0.2mg/mL進行響應(yīng)面試驗。

2.1.8 LA添加時間的影響

圖8 LA添加時間對CLA得率的影響Fig.8 Effect of addition time of LA on the yield of CLA

如圖8所示，在菌體培養(yǎng)10h后添加LA，CLA得率達到最大值?？赡苡捎谂囵B(yǎng)時間過短，菌株生長較弱，LA將影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，抑制其分裂、繁殖；培養(yǎng)時間過長時，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)迅速減少，LA被當(dāng)作營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用了。

2.2 響應(yīng)面試驗[14-15]

2.2.1 回歸方程的檢驗與優(yōu)化

Box-Behnken設(shè)計對3個因素分為3個水平進行編碼，設(shè)計17組試驗，分為12個析因點和5個零點。其中析因點為自變量，取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點上；零點為區(qū)域的中心點，零點重復(fù)5次，以估計試驗誤差。Box-Benhnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果見表2。其中編碼因素取值為A、B、C，分別代表溫度、LA質(zhì)量濃度及pH值。運用Design Expert 6.0對表2的數(shù)據(jù)進行二次回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3，得到回歸方程如下：

表2 Box-Benhnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design and experimental results

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Significance of coefficients of quadratic regression model

由表3可知，模型對試驗擬合良好，模型的P＜0.0001＜0.05，表明該試驗?zāi)Ｐ惋@著。失擬項P=0.1169＞0.05，說明失擬項檢驗不顯著，方程對試驗的擬合度較好，此方法可靠。其中，pH值0.0001＜0.01，表明pH值對CLA得率的影響達到極顯著水平；溫度0.0130＜0.05，達到顯著水平。此外，該模型的變異系數(shù)為3.22%，在可接受范圍內(nèi)。

2.2.2 響應(yīng)面分析圖

通過多元回歸方程分析得知3個因素及其交互作用對CLA得率的影響。該影響可用響應(yīng)面和等高線表示。圖9～11分別表示溫度和LA質(zhì)量濃度、溫度和pH值、LA質(zhì)量濃度和pH值3個因素對CLA得率的影響。

響應(yīng)面圖是指在其他因素固定的條件下，響應(yīng)值與試驗中的兩個因素所構(gòu)成的三維曲面圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響。由圖10～12可知，3個因素在所選擇范圍之內(nèi)均能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值，說明三因素的選擇及其試驗范圍合理有效。其中，響應(yīng)值隨著三因素的上升而顯著增大，各因素值過高，響應(yīng)值又呈下降趨勢；溫度和LA質(zhì)量濃度的交互作用較顯著，LA質(zhì)量濃度和pH值、溫度和pH值的交互作用較小，近似圓形。

圖9 溫度和LA質(zhì)量濃度對CLA得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation temperature and LA concentration on the yield of CLA

圖10 溫度和pH值對CLA得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation temperature and pH on the yield of CLA

圖11 LA質(zhì)量濃度和pH值對CLA得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots showing the interactive effects of LA concentration and pH on the yield of CLA

2.2.3 最優(yōu)工藝條件

由Design軟件可得CLA得率的最佳工藝條件：溫度29.35℃、LA質(zhì)量濃度0.209mg/mL、初始pH6.31，此條件下，CLA理論得率為45.326μg/mL。為檢驗RSM法的可靠性，在最佳條件下進行驗證實驗。考慮實際操作，將最佳條件修正為：溫度30℃、LA質(zhì)量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3。此條件下，進行3次驗證實驗，CLA平均得率為44.77μg/mL，與理論預(yù)測值基本相符，說明該回歸方程能較真實的模擬三因素對CLA得率的影響。

3 結(jié) 論

本實驗對植物乳桿菌lp15-2-1生長細胞轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的基本特性進行了研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Design expert 6.0軟件采用Box-Benhnken試驗設(shè)計法對植物乳桿菌產(chǎn)共軛亞油酸的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、初始pH值、LA質(zhì)量濃度對共軛亞油酸得率有顯著影響。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件為：溫度30℃、LA質(zhì)量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3，此條件下，CLA的實際得率為44.77μg/mL，轉(zhuǎn)化率為21.32%，與優(yōu)化前轉(zhuǎn)化率(7.78%)相比，有了很大提高，說明該響應(yīng)面模型可優(yōu)化CLA發(fā)酵工藝條件。

[1] PARODI P W. Conjugated octadecadienoic acids of milk fat[J]. Journal of Dairy Science, 1977, 60(10):1550-1553.

[2] BRITTON M, FONG C, WICKENS D, et al. Diet as a source of phospholipid esterified 9, 11-octadecadienoic acid in humans[J]. Clinlical Sscience, 1992, 83(1):97-101.

[3] SHULTZ T D, CHEW B P, SEAMAN W R. Differential stimulatory and inhibitory responses of human MCF-7 breast cancer cells to linoleic acid and conjugated linoleic acid in culture[J]. Anticancer Research,1992, 12(6B):2143-2145.

[4] HA Y L, GRIMM N K, PARIZA M W. Anticarcinogens from fried ground beef:heat-altered derivatives of linoleic acid[J]. Carcinogenesis,1987, 8(12):1881-1887.

[5] 劉佩, 沈生榮, 阮暉, 等. 共軛亞油酸的生理學(xué)功能及健康意義[J].中國糧油學(xué)報, 2009, 24(6):161-165.

[6] GANGIDI R R, PROCTOR A. Photochemical production of conjugated linoleic acid from soybean oil[J]. Lipids, 2004, 39(6):577-582.

[7] LIN T Y, LIN C W, WANG Y J. Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts fromLactobacillus acidophilusandPropionibacterium freudenreichiissp.Shermanii[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(4):1502-1505.

[8] 邵群, 張慧, 邊際, 等. 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生共軛亞油酸條件的研究[J].山東師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2010, 16(4):443-446.

[9] KIM Y J, LIU R H. Increase of conjugated linoleic acid content in milk by fermentation with lactic acid bacteria[J]. Journal of Food Science,2002, 67(5):1731-1737.

[10] ALONSO L, CUESTA E P, GILLILAND S E. Production of free conjugated linoleic acid byLactobacillus acidophilusandLactobacillus caseiof human intestinal origin[J]. Journal of Dairy Science, 2003, 86(6):1941-1946.

[11] 張中義. 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[12] PARIZA M W, YANG X Y. Method of producing conjugated fatty acids:USA, 6060304[P]. 2000-05-09.

[13] 劉佩, 周倩, 沈生榮, 等. 產(chǎn)共軛亞油酸植物乳桿菌的篩選、鑒定與誘變[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(9):135-139.

[14] 王根女, 蘇平, 黃愷婷, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取紫蘇葉多酚物質(zhì)[J]. 中國食品學(xué)報, 2009, 9(5):87-92.

[15] 朱鳳妹, 杜彬, 李軍, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉3.481產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵工藝的研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2009, 9(5):35-42.

Optimization of Fermentation Conditions for Producing Conjugated Linoleic Acid inLactobacillus plantarumlp15-2-1 by Response Surface Analysis

ZHOU Qian，LIU Pei，MA Liu-liu，RUAN Hui，HE Guo-qing*(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

Q815

A

1002-6630(2010)21-0195-05

2010-02-06

國家“863”計劃重點項目(2007AA100402)

周倩(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：zyq04010@163.com

*通信作者：何國慶(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程。E-mail：gqhe@zju.edu.cn