天然促生長(zhǎng)因子促進(jìn)益生菌發(fā)酵牛骨粉鈣轉(zhuǎn)化的工藝優(yōu)化

吳 敏，羅愛(ài)平*，尹彥洋，劉芝澤

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院計(jì)算機(jī)應(yīng)用系，貴州 銅仁 554300；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

天然促生長(zhǎng)因子促進(jìn)益生菌發(fā)酵牛骨粉鈣轉(zhuǎn)化的工藝優(yōu)化

吳 敏1，羅愛(ài)平2,*，尹彥洋2，劉芝澤2

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院計(jì)算機(jī)應(yīng)用系，貴州 銅仁 554300；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

利用益生菌發(fā)酵牛骨粉，添加8種天然益生菌促生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)酵牛骨粉。通過(guò)單因素試驗(yàn)，篩選益生菌促生長(zhǎng)因子。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以游離鈣轉(zhuǎn)化率為特征性指標(biāo)，優(yōu)化幾種天然促生長(zhǎng)因子的最佳組合。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：玉米汁、番茄汁、豆芽汁、白菜汁、胡蘿卜汁、牛奶均對(duì)益生菌有促生長(zhǎng)作用，除玉米汁外，發(fā)酵終止時(shí)的pH值越低、活菌數(shù)越大，鈣轉(zhuǎn)化率越高。白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最適添加量均為15%，胡蘿卜汁為20%，玉米汁為5%。馬鈴薯汁對(duì)鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌及兩者協(xié)同發(fā)酵時(shí)均有抑制作用。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：番茄汁、豆芽汁、白菜汁、胡蘿卜汁4種促生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)酵牛骨粉鈣轉(zhuǎn)化率的最優(yōu)組合為：白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡蘿卜汁20.0%，在該條件下鈣轉(zhuǎn)化率可達(dá)38.8%。

益生菌；牛骨粉；促生長(zhǎng)因子；鈣轉(zhuǎn)化率

Abstract：Natural growth-promoting factors were added to probiotic fermentation of fresh cattle bone meal for exploring the synergistic effect on the conversion rate of calcium. Single factor experiments were used to select probiotics. Meanwhile,orthogonal experiments were used to explore the optimal combination of growth factors on the basis of conversion rate of free calcium. Results indicated that corn juice, tomato juice, bean sprout juice, cabbage juice, carrot juice and milk have obvious growth-promoting effect on probiotics. Except for corn juice, the lower pH at the end of fermentation could result in the greater number of viable cells and the higher conversion rate of calcium. In addition, the optimal addition amount of cabbage juice, tomato juice, bean sprout juice and milk was 15%, whereas 20% for carrot juice and 5% for corn juice. Potato juice exhibited an inhibitory effect on the fermentation ofLactobacillus rhamnosus,Lactobacillus acidophilus, and their combinatorial fermentation.Orthogonal experimental results showed that the optimal combinatorial formula of four growth-promoting factors were 18.0%cabbage juices, 15.0% bean sprout juice, 12.0% tomato juice and 20.0% carrot juice. The conversion rate of calcium was up to 38.8% at the condition of this optimal combinatorial formula.

Key words：probiotics；bovine bone meal；growth-promoting factor；conversion rate of calcium

利用益生菌發(fā)酵含適宜鈣磷比(2:1)的牛骨粉[1]，不僅由于乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸使結(jié)合態(tài)的鈣轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)[2]，而且水解牛骨蛋白，提供了輔助鈣吸收的氨基酸和磷[3]。由于益生菌的不完全蛋白分解酶系，其生長(zhǎng)所需的低氧化還原電勢(shì)及對(duì)微量元素的需求，一般發(fā)酵液很難滿足，導(dǎo)致發(fā)酵效率偏低[4-5]。天然促生長(zhǎng)因子，如白菜汁、胡蘿卜汁、番茄汁、豆芽汁等含有益生菌生長(zhǎng)所必需的氨基酸和蛋白質(zhì)，同時(shí)還含有益生菌生長(zhǎng)所需的維生素和微量元素，可促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)繁殖，提高其發(fā)酵效率[6]。

本研究在益生菌發(fā)酵牛骨粉實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)添加制作簡(jiǎn)便、來(lái)源豐富、成本低、增殖明顯的天然益生菌促生長(zhǎng)因子，提高產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)與鈣轉(zhuǎn)化率。通過(guò)對(duì)益生菌增殖因子的篩選，確定促生長(zhǎng)因子的添加量，優(yōu)化促生長(zhǎng)因子的組合。進(jìn)一步將補(bǔ)鈣劑與促進(jìn)鈣吸收利用的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑有機(jī)地結(jié)合在一起。為開(kāi)發(fā)生物態(tài)補(bǔ)鈣制劑提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛骨粉由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全系提供；雪花牌啤酒，購(gòu)于貴陽(yáng)花溪佳宇超市。

1.2 儀器與設(shè)備

HI208磁力攪拌多用綜合酸度測(cè)定儀 北京哈納科儀科技有限公司；LDZM-50立式壓力蒸汽滅菌器 上海長(zhǎng)城儀表廠；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱 上海興都儀器設(shè)備有限公司。

①項(xiàng)目區(qū)的劃定主要是以鄉(xiāng)鎮(zhèn)為基本范圍，但不限于按鄉(xiāng)鎮(zhèn)劃分。根據(jù)規(guī)劃投資控制規(guī)模，統(tǒng)籌考慮各級(jí)政府資金配套、資金整合和資金籌措能力，遵循“相對(duì)集中、地方自愿、公開(kāi)公正”的原則合理選擇項(xiàng)目區(qū)。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus，LGG)，菌種編號(hào)1.2466；嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，LA)，菌種編號(hào)1.1854；均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

鼠李糖乳桿菌與嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基(未添加碳酸鈣)。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將菌種進(jìn)行活化復(fù)壯，測(cè)其活菌數(shù)[7]。以24h內(nèi)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(活菌數(shù)＞106CFU/mL)為止。

1.4.2 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

菌種活化后，以3%的比例接種于種子液，37℃100r/min 振蕩培養(yǎng)，測(cè)其活菌數(shù)，以24h內(nèi)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(活菌數(shù)＞ 106CFU/mL)為止[8]。

1.4.3 牛骨粉發(fā)酵液制備

按質(zhì)量濃度骨粉5g/100mL、葡萄糖11g/100mL、雙蒸水84%，pH6.2制備牛骨粉發(fā)酵液[8]。

1.4.4 天然促生長(zhǎng)因子的篩選

1.4.4.1 天然促生長(zhǎng)因子的制備

豆芽汁：豆芽500g洗凈，加少量蒸餾水制漿，煮沸15min，四層紗布過(guò)濾，加水調(diào)節(jié)濾液的質(zhì)量，使豆芽與濾液的比例1:1.5(m/V)，再將濾液2500r/min離心10min，除去固體雜質(zhì)，取上清液，置－15℃?zhèn)溆?；白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁和玉米汁制備方法與豆芽汁相同；牛奶經(jīng)脫脂處理后置－15℃?zhèn)溆谩?/p>

促生長(zhǎng)因子的初步篩選：在MRS培養(yǎng)基中分別添加體積分?jǐn)?shù)10%的豆芽汁、白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、玉米汁、牛奶和啤酒，發(fā)酵20h，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，以活菌數(shù)為特征性指標(biāo)，篩選促LGG、LA生長(zhǎng)因子。

促生長(zhǎng)因子的確定：采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將初步篩選的促生長(zhǎng)因子分別按體積分?jǐn)?shù)5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%的用量添加到發(fā)酵液中，以接種量3%，菌種LGG:LA為4.67:1(m/m)，37℃、100r/min振蕩培養(yǎng)69.96h[7]以鈣轉(zhuǎn)化率為評(píng)定指標(biāo)，篩選出具有明顯促進(jìn)鈣轉(zhuǎn)化的促生長(zhǎng)因子及添加量。

1.4.5 天然促生長(zhǎng)因子促進(jìn)益生菌發(fā)酵牛骨粉的工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響鈣轉(zhuǎn)化率較為明顯的4種促生長(zhǎng)因子，采用L9(34)正交試驗(yàn)，以鈣轉(zhuǎn)化率為評(píng)定指標(biāo)，對(duì)4種促生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)酵牛骨粉條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.6 測(cè)定指標(biāo)

1.4.6.1 骨粉中水分測(cè)定

按照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品水分含量測(cè)定》中的直接干燥法測(cè)定。

1.4.6.2 鈣轉(zhuǎn)化率測(cè)定

鈣含量測(cè)定：采用GB/T 9695.13—2009《肉與肉制品鈣含量測(cè)定》中的高錳酸鉀滴定法測(cè)定。

1.4.6.3 pH值測(cè)定

在(25.0±0.5)℃條件下，采用HI208磁力攪拌多用綜合酸度測(cè)定儀測(cè)定各發(fā)酵液pH值。

1.4.6.4 活菌數(shù)測(cè)定

按照GB/T 4789.35—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗(yàn)》中的平板傾注法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析，用Origin 7.0軟件繪制圖形，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨粉成分測(cè)定結(jié)果

隨機(jī)取樣平行測(cè)定，測(cè)得本實(shí)驗(yàn)中所制備的原料牛骨粉的平均含水率為7.63%；平均鈣含量為2.05×104mg/100g。

表1 不同促生長(zhǎng)因子對(duì)益生菌活菌數(shù)的影響Table 1 Effects of growth-promoting factors on the number of viable probiotics CFU/mL

2.2 促生長(zhǎng)因子對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響

2.2.1 促生長(zhǎng)因子篩選實(shí)驗(yàn)

據(jù)報(bào)道[10-15]，豆芽汁、白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、玉米汁、牛奶和啤酒等有促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的作用，選擇這8種天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)因子。不同促生長(zhǎng)因子促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

由表1可知，LGG組：白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁活菌數(shù)分別為3.22×1011、1.45×1011、37.2×1011、19.8×1011CFU/mL，均明顯高于空白組0.58×1011CFU/mL，表明其對(duì)LGG生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用；牛奶、玉米汁活菌數(shù)與空白組無(wú)顯著性差異，即牛奶、玉米汁對(duì)LGG的促生長(zhǎng)效果不顯著。馬鈴薯汁、啤酒活菌數(shù)均低于空白組，表明其對(duì)LGG的生長(zhǎng)有抑制作用。白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁對(duì)LG G的促生長(zhǎng)效果大小為：番茄汁＞胡蘿卜汁＞白菜汁＞豆芽汁。

LA組：白菜汁、番茄汁、胡蘿卜汁、啤酒、玉米汁活菌數(shù)分別為12.29×109、7.78×109、13.13×109、2.01×109、2.02×109CFU/mL均明顯高于空白組1.15×109CFU/mL，表明它們促LA生長(zhǎng)效果明顯。牛奶、豆芽汁活菌數(shù)與空白組無(wú)顯著性差異，即牛奶與豆芽汁對(duì)LA的促生長(zhǎng)效果不明顯。馬鈴薯汁活菌數(shù)低于空白組，表明其對(duì)LA生長(zhǎng)有抑制作用。不同促生長(zhǎng)因子對(duì)LA的促生效果大小為：胡蘿卜汁＞白菜汁＞番茄汁＞啤酒≈玉米。

LGG:LA組：白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁活菌數(shù)分別為5.82×1010、2.43×1010、4.36×1010、3.39×1010CFU/mL均明顯高于空白組0.88×1010CFU/mL，均能促進(jìn)LGG與LA共生。牛奶、啤酒、玉米汁活菌數(shù)與空白組無(wú)顯著性差異，即牛奶對(duì)LGG與LA共同生長(zhǎng)無(wú)明顯的促進(jìn)作用。馬鈴薯汁活菌數(shù)低于空白組，表明其對(duì)LGG與LA生長(zhǎng)有抑制作用。白菜汁、豆芽汁、番茄汁、胡蘿卜汁4種促LGG與LA共生作用的效果為：白菜汁＞番茄汁＞胡蘿卜汁＞豆芽汁。

綜上所述，馬鈴薯對(duì)LGG、LA及LGG＋LA均有抑制作用，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。根據(jù)8個(gè)促生長(zhǎng)因子對(duì)LGG與LA促生長(zhǎng)效果的大小，并與空白組比較，舍去啤酒與馬鈴薯汁兩種對(duì)益生菌無(wú)明顯促生長(zhǎng)效果或有抑制作用的因子，對(duì)其余6個(gè)促生長(zhǎng)因子進(jìn)一步篩選。

2.2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同促生長(zhǎng)因子中鈣含量有所差異，為排除其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，對(duì)各促生長(zhǎng)因子中鈣含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。再進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各促生長(zhǎng)因子中的鈣含量Table 2 Calcium contents of growth-promoting factors

表3 單因素試驗(yàn)主要測(cè)定指標(biāo)結(jié)果Table 3 Effects of type and amount of added growth-promoting factors on conversion rate of calcium

由表3可知，白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量在5.0%～15.0%時(shí)，鈣轉(zhuǎn)化率隨白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量的增大而升高，添加量為15.0%時(shí)達(dá)最大值，分別為31.75%、31.75%、30.48%、24.13%，比最小值分別提高13.64%、19.05%、20.00%、15.23%。添加量在15%～25%時(shí)，鈣轉(zhuǎn)化率隨添加量的增大而降低；胡蘿卜汁添加量在5.0%～20.0%時(shí)，鈣轉(zhuǎn)化率隨胡蘿卜汁添加量的增大而升高，添加量為20.0%時(shí)達(dá)最大值33.34%，比最小值26.94%，提高23.76%。胡蘿卜汁添加量在20.0%～25.0%時(shí)，鈣轉(zhuǎn)化率隨胡蘿卜汁添加量的增大而降低；隨玉米汁添加量的增大，鈣轉(zhuǎn)化率降低。添加量為5.0%時(shí)達(dá)29.21%，比最小值提高29.59%。結(jié)果表明，玉米汁的添加量與鈣轉(zhuǎn)化率成反比。

綜上所述：適量濃度的白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶、胡蘿卜汁有利于益生菌生長(zhǎng)，有助于骨粉中鈣轉(zhuǎn)化率提高。

如表3所示，添加量過(guò)大也會(huì)抑制益生菌的生長(zhǎng)，降低鈣轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明：白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶添加量為15.0%為宜。胡蘿卜汁添加量20.0%為宜。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最適添加量均為15%，胡蘿卜汁為20%，玉米為5%。除玉米汁試驗(yàn)組外，pH值越低、活菌數(shù)越大，鈣轉(zhuǎn)化率越高。用SPSS 12.0軟件對(duì)不同促生長(zhǎng)因子pH值、活菌數(shù)和鈣轉(zhuǎn)化率進(jìn)行相關(guān)性分析，得出pH值、活菌數(shù)與鈣轉(zhuǎn)化率之間無(wú)顯著(P＞0.05)的相關(guān)性。

2.3 益生菌發(fā)酵正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步提高鈣轉(zhuǎn)化率，選取胡蘿卜汁、番茄汁、豆芽汁和白菜汁4種促鈣轉(zhuǎn)化效果明顯的促生長(zhǎng)因子為因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以鈣轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)評(píng)價(jià)4種促生因子協(xié)同作用對(duì)益生菌發(fā)酵牛骨粉鈣轉(zhuǎn)化率的影響。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Orthogonal array design layout and experimental results

由表5中極差分析可知，4個(gè)因素對(duì)鈣轉(zhuǎn)化率的影響次序是：C＞B＞A＞D，即番茄汁＞豆芽汁＞白菜汁＞胡蘿卜汁。最優(yōu)組合為A3B2C1D2，即白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡蘿卜汁20.0%。經(jīng)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鈣轉(zhuǎn)化率為38.8%。此結(jié)果與第8組試驗(yàn)組A3B2C1D3鈣轉(zhuǎn)化率達(dá)最大值38.1%的結(jié)果極為相近，相對(duì)偏差僅1.84%，只影響效果最小的D因素不同，表明試驗(yàn)的最佳理論組與實(shí)際相符合，結(jié)果可靠。

4 結(jié) 論

4.1 豆芽汁、白菜汁、番茄汁、馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、玉米汁、牛奶、啤酒8種對(duì)LGG的促生效果大小為：番茄汁＞胡蘿卜汁＞白菜汁＞豆芽汁＞空白牛奶，玉米汁、啤酒對(duì)LGG的促生長(zhǎng)效果不明顯；對(duì)LA的促生長(zhǎng)效果大小為：胡蘿卜汁＞白菜汁＞番茄汁＞啤酒、玉米汁＞空白，牛奶、豆芽汁對(duì)LA的促生長(zhǎng)效果不明顯；對(duì)LGG＋LA的促生長(zhǎng)效果大小為：白菜汁＞番茄汁＞胡蘿卜汁＞豆芽汁＞空白，牛奶、玉米汁、啤酒對(duì)LGG＋LA的促生效果不明顯。而馬鈴薯對(duì)LGG、LA及LGG＋LA均有抑制作用，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，白菜汁、番茄汁、豆芽汁、牛奶最適添加量均為15%，胡蘿卜汁為20%，玉米汁為5%。除玉米汁外，發(fā)酵終止時(shí)的pH值越低、活菌數(shù)越大，鈣轉(zhuǎn)化率越高。

4.3 正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4種促生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)酵牛骨粉鈣轉(zhuǎn)化率影響主次因素為番茄汁＞豆芽汁＞白菜汁＞胡蘿卜汁。最優(yōu)組合為白菜汁18.0%、豆芽汁15.0%、番茄汁12.0%、胡蘿卜汁20.0%、鈣轉(zhuǎn)化率可達(dá)38.8%。

4.4 天然促生長(zhǎng)因子的原料如豆芽、白菜、番茄、馬鈴薯、胡蘿卜、玉米等因采收季節(jié)、地域、品種不同，營(yíng)養(yǎng)成分含量有所差異，如何保證其對(duì)益生菌的促生長(zhǎng)效果穩(wěn)定有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of Amounts of Added Natural Growth-promoting Factors for Fermentation of Cattle Bone Meal by Probiotics for Calcium Conversion

WU Min1，LUO Ai-ping2,*，YIN Yan-yang2，LIU Zhi-ze2
(1. Department of Computer and Applications, Tongren Polytechnic, Tongren 554300, China；2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

TS251.2

A

1002-6630(2010)21-0222-04

2010-01-20

貴州省科技廳資助項(xiàng)目(黔科合NY字[2007]3021號(hào))；貴州現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(GZCYTX-0301-03)

吳敏(1968—)，女，副教授，碩士，主要從事畜產(chǎn)品加工研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：trzywumin@163.com

*通信作者：羅愛(ài)平(1958—)，女，教授，本科，主要從事畜產(chǎn)品加工研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：luoaiping58@126.com