高效液相色譜雙波長檢測法測定維C銀翹片中4種組分的含量

董 麗, 孫祥德, 李 琴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南新鄉(xiāng)453003)

高效液相色譜雙波長檢測法測定維C銀翹片中4種組分的含量

董 麗＊, 孫祥德, 李 琴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院,河南新鄉(xiāng)453003)

建立了高效液相色譜測定維C銀翹片中維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏和綠原酸4種組分含量的方法。研究優(yōu)化了樣品提取的溶劑與超聲提取條件、色譜分離條件和檢測波長等,采用了Sinochrom ODS-BP(4.6 mm×200mm,5μm)色譜柱,以0.05mol/L KH2PO4(pH3.0,含1%三乙胺)-乙腈(75∶25,v/v)為流動相,雙檢測波長260nm和326nm等分離檢測條件。結果表明,維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏和綠原酸的測定線性范圍均比較寬,方法平均回收率大于99.4%,相對標準偏差(RSD)小于1.8%(n=5),而且測定方法快速、簡便、準確,非常適合維C銀翹片類藥物的質量控制。

高效液相色譜法;雙檢測波長;維生素C;對乙酰氨基酚;馬來酸氯苯那敏;綠原酸;維C銀翹片

Abstract:A reversed-phase high performance liquid Chromatographic(RP-HPLC)method with dual wavelength detection was developed for the determination of vitamin C,paracetamol,chlorphenamine maleate and chlorogenic acid in Vitamin C Yinqiao Tablets.The separation was perform ed on a Sinochrom ODS-BP column with the mobile phase consisting of0.05mol/L KH2PO4(pH3.0,containing1%triethylamine and acetonitrile(75∶25,v/v).The detection wavelength was set at260nm(λ1)and326nm(λ2).The method linearities were wide and the average recoveries were more than99.4%.The relative standard deviations were less than 1.8%(n=5).This method is convenient,rap id and accurate.It is readily applied to the quality controls in the production process of Vitamin C Yinqiao Tablets.

Key words:high performance liquid Chromatography(HPLC);dual detection wavelengths;vitamin C;paracetamol;chlorphena mine maleate;chlorogenic acid;Vitamin C Yinqiao Tablets

維C銀翹片是由金銀花、連翹等13味中藥添加維生素C、對乙酰氨基酚和馬來酸氯苯那敏3種西藥成分所組成的復方制劑,具有辛涼解表、清熱解毒之功效,用于治療流行性感冒引起的發(fā)熱、頭疼、咳嗽、口干、咽喉疼痛等癥。目前,國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準(WS3-B-4000-98-2003)中僅規(guī)定了維生素C和對乙酰氨基酚含量的測定,對其他成分無含量控制標準。金銀花是該制劑中中藥組方之君藥,綠原酸為其主要活性成分,對本方的臨床療效具有重要的作用;馬來酸氯苯那敏由于在該制劑中的含量較低,且不易混勻,現(xiàn)行的國家標準也未收載對其含量均勻度的測定。因此,在本制劑中增加綠原酸和馬來酸氯苯那敏的含量測定,對全面有效地控制產品質量具有重要的意義。目前,利用光譜法[1-3]、薄層掃描法[4]、毛細管電泳-化學發(fā)光法[5]及高效液相色譜法(HPLC)[6-8]等進行維C銀翹片中維生素C、馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚或綠原酸等組分的含量測定多有報道,但這些方法大多是測定其中1種或同時測定其中2種組分。有采用高效毛細管電泳法(HPCE)的膠束電動毛細管色譜(M ECC)模式同時測定對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、維生素C和綠原酸4種組分含量的報道[9],但由于HPCE自身的重現(xiàn)性較差,使其難以應用于藥品的質量控制。利用HPLC測定維C銀翹片中維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏和綠原酸4種組分的含量鮮有報道。本文通過優(yōu)化樣品提取條件和色譜分離條件,用外標法定量,建立了HPLC雙波長檢測法測定該4種組分含量的方法,并應用于實際樣品的測定。方法操作簡便,其靈敏度、準確性和重現(xiàn)性均優(yōu)于已報道的方法。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺為分析純試劑,乙腈為色譜純(天津科密歐化學試劑有限公司)。維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏和綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)。維C銀翹片為市售,系3個廠家共9個批次樣品(A廠:070386,070345,070320;B廠:070803,070827,070908;C廠:070610,070508,070628;標示量:維生素C49.5 m g/片,對乙酰氨基酚105m g/片,馬來酸氯苯那敏1.05m g/片)。實驗用水均為自制二次蒸餾水。

1.2 儀器及色譜條件

日本島津公司的LC-6AD高效液相色譜儀,配LC-solution色譜工作站和SPD-20A紫外檢測器等;XK96-A快速混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);pHS-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)。色譜柱:大連依利特公司Sinochrom ODS-B P(200mm×4.6mm,5μm),預柱:C18(25 mm×4.6mm);流動相:0.05mol/L KH2PO4(pH 3.0,含1%三乙胺)-乙腈(75∶25,v/v);檢測波長:260nm和326nm;流速:1.0mL/m in;柱溫:25℃;進樣量:20μL;用外標法定量。

1.3 樣品溶液的制備

取藥品20片,除去包衣,精密稱定,計算平均片重。粉碎研磨后精密稱取適量(約相當于1片的質量),置于100mL容量瓶中,加流動相適量,間歇超聲處理使之溶解,用流動相稀釋至刻度,搖勻,過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液A,用于測定馬來酸氯苯那敏和綠原酸。取供試品溶液A2.50mL置于100 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,得供試品溶液B,用于測定維生素C和對乙酰氨基酚。

1.4 對照品溶液的制備

分別準確稱取維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏和綠原酸對照品適量,以流動相溶解,配制4組分對照品儲備液,其質量濃度分別為1.030,1.020,1.090和0.500 0g/L。量取維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸3種儲備液各5.00mL,馬來酸氯苯那敏儲備液10.00mL置于同一50mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,得4組分混合對照品溶液,混合溶液中各組分的質量濃度分別為維生素C 103.0m g/L,綠原酸50.00m g/L,對乙酰氨基酚102.0m g/L,馬來酸氯苯那敏218.0m g/L。將此混合對照品溶液用流動相依次等體積稀釋,得到系列質量濃度的混合對照品溶液。

2 結果與討論

2.1 樣品溶液制備方法的選擇

馬來酸氯苯那敏和維生素C在水中易溶,而綠原酸和對乙酰氨基酚在水中溶解度較小。根據(jù)4組分的溶解性,本文曾試驗以水、甲醇、不同比例的甲醇-水及本文最終選定的流動相等不同的提取溶劑進行提取。結果顯示,用水提取時,對乙酰氨基酚和綠原酸提取不完全,而合適比例的甲醇-水混合溶劑雖能對各被測組分有較好的提取率,但提取的共存成分較多,干擾被測組分的分離。用流動相提取不僅提取完全,而且干擾組分少,又不產生溶劑峰。因此,本文選擇用流動相作提取溶劑。同時還試驗了室溫下浸取、振蕩、超聲提取等不同的提取方式。結果表明,超聲提取簡便快速、提取完全;但由于維生素C對熱不穩(wěn)定,超聲所產生的熱量會使其破壞,從而影響測定結果的準確度。同時,綠原酸在酸性介質(pH2～4)中的穩(wěn)定性較好[10],但在較高溫度下會加速其分子中酯鍵的水解。因此,為確保提取過程中維生素C和綠原酸不被破壞且提取完全,本文采用間歇超聲提取的方式。

2.2 檢測波長的選擇

以流動相為空白,在200～400nm范圍內掃描,維生素C、對乙酰氨基酚、綠原酸和馬來酸氯苯那敏的最大吸收波長分別為245,249,326和260 nm。由于綠原酸與其他3組分的最大吸收波長相差懸殊,故采用雙波長同時檢測模式進行檢測。該制劑中馬來酸氯苯那敏的處方量甚小,故選擇260 nm作為測定的第一檢測波長,在此波長下,維生素C和對乙酰氨基酚也具有較大的吸收,檢測靈敏度足以達到分析要求。以綠原酸的最大吸收波長326 nm作為第二檢測波長對綠原酸進行檢測。雙波長檢測模式兼顧了各組分的含量差別和檢測靈敏度,實現(xiàn)了在同一色譜條件下4組分含量的同時測定。

文獻[11]在以HPLC測定維C銀翹片中的上述4組分的含量時,選擇219nm檢測維生素C、對乙酰氨基酚和馬來酸氯苯那敏,盡管3組分在219 nm波長下具有較強吸收,但由于維C銀翹片中含有大量的中藥成分,基質復雜,經溶劑提取制備的供試品溶液中含有大量的有末端吸收的共存成分,從而干擾被測組分的分離測定。另外,該文獻使用甲醇-水-冰醋酸(體積比為20∶80∶0.2)為提取溶劑,冰醋酸在219nm處也有吸收,從而產生溶劑峰。本文結果顯示,選擇在260nm處檢測維生素C、對乙酰氨基酚和馬來酸氯苯那敏3組分,不僅檢測靈敏度足以達到分析要求,而且有效地減少了大量具有末端吸收的未知共存成分的干擾。

2.3 流動相的選擇

馬來酸氯苯那敏是氯苯那敏的馬來酸鹽,將出現(xiàn)馬來酸和氯苯那敏兩個色譜峰。本實驗表明,流動相中乙腈的比例對綠原酸和氯苯那敏的保留行為影響很大,調整乙腈和緩沖鹽的比例,可實現(xiàn)各組分的分離。流動相中加入少量的三乙胺不僅可以調節(jié)各組分的保留時間,而且可很好地改善氯苯那敏的峰形。曾試驗不同pH值的緩沖溶液對各待測組分分離的影響,結果顯示,改變流動相的pH值對維生素C、馬來酸、綠原酸和對乙酰氨基酚的保留時間幾乎沒有影響,而氯苯那敏的保留時間則隨著pH值的降低而縮短。這是由于氯苯那敏分子中含有叔氨基,溶液的酸度增加有利于該氨基的質子化,從而使其極性增大,導致其在反相色譜柱上的保留減弱。盡管酸度的降低有利于氯苯那敏較早出峰,但ODS柱難以承受pH2以下的酸度,且維生素C在過高的酸度下不穩(wěn)定;而綠原酸分子結構中含有的酯鍵,其水溶液在中性和堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較差,但在pH 2～4下較穩(wěn)定。經優(yōu)化,最終確定流動相為0.05 mol/L KH2PO4(pH3.0,含1%三乙胺)-乙腈(75∶25,v/v)。在本文選定的色譜條件下,經用不含待測組分的空白樣品進行試驗,試樣中提取的未知組分不干擾待測組分的測定。

目前,采用HPLC分離分析馬來酸氯苯那敏的報道很多,但有不少文獻報道的測定條件[12-16]值得商榷。由于馬來酸的極性較大,而氯苯那敏的極性較弱,所以馬來酸在反相色譜上的保留弱于氯苯那敏。流動相中有機溶劑相的比例對氯苯那敏的保留時間影響甚大,當有機相的比例較低時,氯苯那敏常常未被洗脫。因此,有不少文獻常將較早洗脫的馬來酸峰誤認為是氯苯那敏峰而進行定量[16]。由于馬來酸氯苯那敏的藥效結構是氯苯那敏,因此在進行馬來酸氯苯那敏的含量測定中以馬來酸峰來定量是不妥的。文獻[11]采用了以甲醇-乙腈-0.02%磷酸(5∶10∶85,v/v)為流動相,柱溫為35℃,檢測波長為310nm和219nm的色譜條件。但經驗證發(fā)現(xiàn)在該文獻的色譜條件下,氯苯那敏在35m in以后出峰(這是由于流動相中甲醇、乙腈比例偏低所致),而用于定量馬來酸氯苯那敏的峰系馬來酸峰,且以末端吸收219nm為檢測波長,干擾成分較多。本實驗改進并優(yōu)化了流動相條件和檢測波長,使維生素C、綠原酸、對乙酰氨基酚和氯苯那敏4組分在10m in內全部出峰并得到了很好的分離。方法學驗證結果顯示,本文方法測定維C銀翹片4組分快速、簡便、準確。

在本文確定的色譜條件下,4組分之間以及與其他未知組分之間得到了很好的分離,以對乙酰氨基酚計,柱效不低于3 000?；旌蠈φ掌啡芤汉蜆悠啡芤旱纳V圖分別見圖1和圖2。

2.4 線性范圍與定量限確定

分別取系列對照品混合液20μL進樣,按照1.2節(jié)色譜條件測定,以各組分峰面積A對相應的質量濃度C回歸制備標準曲線。當信噪比(S/N)為10時,確定4種化合物的定量限。結果(見表1)表明,4種組分的峰面積與進樣濃度之間線性關系良好,線性范圍寬,靈敏度高。

圖1 雙檢測波長下4組分混合對照品溶液的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the standard solution at the dual detection wave lengths

圖2 雙檢測波長下供試品溶液的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of the sample solutions at the dual detection wave lengths

表1 4種組分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍與定量限(S/N=10)Table1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges and limits of quantification(LOQ,S/N=10)of four components

2.5 精密度試驗

配制4種組分高、中、低3個濃度的對照品溶液,其中維生素C溶液的質量濃度分別為0.201 1,6.438,103.0m g/L;對乙酰氨基酚溶液的質量濃度分別為0.199 2,3.188,51.00m g/L;綠原酸溶液的質量濃度分別為0.097 60,3.125,50.00m g/L;馬來酸氯苯那敏溶液的質量濃度分別為0.425 5,13.62,218.0m g/L。上述各溶液重復進樣5次進行含量測定及日內精密度(以相對標準偏差(RSD)計)測定;每種溶液連續(xù)5d配制測定,計算日間精密度。結果表明,各組分高中低3種濃度溶液的日內精密度均小于1.0%,日間精密度均小于1.8%。

2.6 回收率試驗

稱取約1片質量的已知含量的樣品(A廠,070386批號)粉末5份,各準確加入含有維生素C 10.00m g、對乙酰氨基酚20.00m g、綠原酸1.00 m g和馬來酸氯苯那敏1.00m g的4組分對照品儲備液適量,置于100mL容量瓶中,用流動相超聲助溶,定容至刻度。過濾,取續(xù)濾液進樣20μL測定馬來酸氯苯那敏和綠原酸。取續(xù)濾液2.50mL于100 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,進樣20μL測定維生素C和對乙酰氨基酚,測定結果見表2。

表2 4種組分的回收率測定結果(n=5)Table2 Recovery results of four components(n=5)

2.7 溶液的穩(wěn)定性試驗

取新配制的樣品供試溶液于室溫下和4℃冰箱中放置,并分別于放置0,1,3,5,7,12,24h取樣20μL進行測定。結果表明,室溫下對乙酰氨基酚、綠原酸和馬來酸氯苯那敏峰面積的RSD分別為0.94%,2.54%和2.67%,表明這3種組分在24h內有較好的穩(wěn)定性;但室溫下維生素C放置3h峰面積即降低了約10%。而放置在4℃冰箱內保存,24h內4組分的峰面積的RSD均小于2.0%。

2.8 耐用性試驗

根據(jù)《中國藥典》2005版藥品質量標準分析方法驗證指導原則,考察了方法的耐用性。按照已確定的色譜條件進行試驗,同一樣品使用同一色譜柱(Spherigel C18柱,200mm×4.6mm,10μm)在3臺不同儀器(Sh im adzu LC-6A,Shim adzu LC-6AD,Varian PROSTAR210)上測定;使用同一臺儀器(Sh im adzu LC-6AD),分別用Sinochrom ODS-B P(200mm×4.6mm,5μm)、Shim adzu VP-ODS(250mm×4.6mm,5μm)和Spherigel C18(200 mm×4.6mm,10μm)3根不同廠家的色譜柱,在不同時間經不同實驗人員測定。結果顯示,4組分的峰形均較理想,相鄰峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于3 000,測定結果的RSD小于2.6%。另外還考察了柱溫和緩沖液pH值等因素的微小變化對分離度和峰面積的影響。結果顯示,當柱溫在±5℃范圍內波動時,測定結果無明顯的差異。分別用pH值為2.80,2.90,3.10的緩沖液配制流動相進行試驗,其實驗結果和分離度無明顯的差異。上述試驗結果顯示,本方法在測定條件有較小的變動時,方法的耐用性良好。

2.9 樣品測定

取3個廠家的9批次維C銀翹片樣品按1.3節(jié)下的方法操作,取供試品溶液20μL進樣分析,其中馬來酸氯苯那敏以氯苯那敏峰的峰面積進行定量,結果見表3。

由于該制劑處方中馬來酸氯苯那敏和綠原酸的含量相對較低,用同一色譜圖定量會存在著部分組分的濃度不在其線性范圍內,故在樣品測定時先制成供試品溶液A供測定馬來酸氯苯那敏和綠原酸,然后將供試品溶液A適當稀釋供測定維生素C和對乙酰氨基酚。

表3的測定結果顯示,不同生產廠家不同批次的維C銀翹片中的對乙酰氨基酚的含量符合規(guī)定,少數(shù)產品維生素C含量不均勻,而馬來酸氯苯那敏和綠原酸兩成分的含量差異較大。因此,規(guī)范穩(wěn)定藥材來源,在該制劑質量標準中增加馬來酸氯苯那敏和綠原酸含量的測定項目,對保證維C銀翹片的質量、安全、有效具有重要的意義。

表3 不同批次維C銀翹片中4組分的含量(n=3)Table3 Contents of four components in vitamin C Yinqiao Table ts(n=3)m g/tablet

3 結論

本文應用HPLC-雙波長檢測建立了同時高靈敏度地測定維C銀翹片中4種組分的含量方法,并進行了方法學驗證。在測定含有馬來酸氯苯那敏的復方制劑的多組分含量時,不僅需要優(yōu)化色譜條件使各待測組分不受干擾,還應特別注意避免將馬來酸峰誤認為氯苯那敏進行定量。本文方法簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可用于維C銀翹片的質量控制。

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Determination of four components in Vitamin C Yinq iao Tablets using reversed-phase high performance liquid chromatography with dual wave length detection

DONG L i＊,SUN Xiangde,LI Q in
(Xinxiang Medica l University,Xinxiang 453003,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0204-05

＊通訊聯(lián)系人:董 麗,副教授,主要研究方向為藥物色譜分析.Tel:(0373)3029128,E-m ail:ldong@xxmu.edu.cn.

新鄉(xiāng)醫(yī)學院高學歷人才基金項目(No.2005YJ31).

2009-07-20

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00204