中藥復(fù)方抗纖抑癌方和復(fù)方鱉甲軟肝片不同采血時(shí)間點(diǎn)藥物血清對(duì)Hep G2肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

趙志敏，葉永安，楊先照，甘大楠，馬賀成，劉 方

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

0 引言

藥物血清因其方法學(xué)上的特點(diǎn)而使其在中醫(yī)學(xué)的研究中具有一定的優(yōu)勢(shì)［1］，也是中醫(yī)藥研究的重要手段。目前研究采用人來源的藥物血清日益增多，但是中藥多是復(fù)方，成分復(fù)雜多樣，多數(shù)中藥人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)不明，在不同時(shí)間點(diǎn)收集到的藥物血清作用效果可能會(huì)存在差異。本實(shí)驗(yàn)我們選取葉永安教授臨床治療原發(fā)性肝癌較為有效的方劑復(fù)方抗纖抑癌方與中成藥復(fù)方鱉甲軟肝片制備人來源藥物血清，采用MTT法檢測(cè)不同抽血時(shí)間點(diǎn)、不同藥物的藥物血清對(duì)HepG2細(xì)胞增殖是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料

人藥物血清取自3名健康志愿者，男性，年齡25歲～32歲之間，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟⒑炗喼橥鈺?，服藥前后各檢查血尿便常規(guī)、肝腎功、心電圖1次。

藥品:復(fù)方抗纖抑癌方:柴胡、黃芪、山藥等。飲片購(gòu)自東直門醫(yī)院中藥房。復(fù)方鱉甲軟肝片由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字 Z19991011，0.5g/片，批號(hào)20090322;

細(xì)胞:HepG2人肝癌細(xì)胞，購(gòu)自武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，常規(guī)復(fù)蘇、傳代后，在37℃5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待用。

試劑:噻唑蘭(Sigma)購(gòu)自北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自sigma公司;MEM培養(yǎng)基干粉購(gòu)自GIBCO公司;胎牛血清購(gòu)自HyClone公司;胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio。實(shí)驗(yàn)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 志愿者在服藥前空腹抽血1次，制備服藥前空白對(duì)照血清;在服用復(fù)方抗纖抑癌方3d后，第4天晨起空腹服藥后0.5h、1h、2h各抽血1次，制備復(fù)方抗纖抑癌方藥物血清;在服用復(fù)方鱉甲軟肝片3d后，第4天晨起空腹服藥后1h、2h 抽血，每次8ml，室溫靜置 30min，離心分離血清(4000r/min，20min)，56℃ 30min 滅活、分裝，于 －70℃保存?zhèn)溆?。服?種藥物之間間隔1周作為洗脫期。

1.2.2 分組 我們先將1h、2h采集的復(fù)方抗纖抑癌方和復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基配成20%、10%、5%共3個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)無(wú)血清MEM組為對(duì)照組，觀察不同抽血時(shí)間點(diǎn)藥物血清作用下的HepG2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。之后追加0.5h采集的復(fù)方抗纖抑癌方藥物血清與其自身1h、2h采血點(diǎn)比較，藥物血清用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基配成20%、10%、5%共3個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)無(wú)血清MEM組為對(duì)照組。最后將0.5h采集的復(fù)方抗纖抑癌方藥物血清、2h采集的復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清與服藥前空白對(duì)照組血清進(jìn)行比較，3種血清用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基配成40%、20%、10%共3個(gè)濃度。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于10%胎牛血清MEM培養(yǎng)液中，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，4d～5d傳代，待細(xì)胞接近長(zhǎng)滿時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.2.4 志愿者藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105ml－，接種于96孔板上，每孔100μl。24h后將原培養(yǎng)液吸棄，換無(wú)血清MEM培養(yǎng)液，每孔100μl，繼續(xù)孵育。24h后將培養(yǎng)液吸棄，復(fù)方鱉甲軟肝片組和抗纖抑癌方組分別加入含不同濃度藥物血清的條件培養(yǎng)基，每孔100μl。另設(shè)無(wú)血清MEM組(或服藥前空白血清組)為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24h后，將原培養(yǎng)液吸棄，換無(wú)血清 MEM 培養(yǎng)液，每孔100μl，再加入5mg/ml MTT 每孔 20μl，孵育 4h，棄上清，每孔加DMSO 150μl，震蕩5min，充分溶解沉淀后，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm處檢測(cè)吸光度數(shù)值(OD值)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。數(shù)據(jù)用珋x±s表示，計(jì)量資料的多組比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 1h、2hKX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表1顯示，KX各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無(wú)論1h還是2h抽血，KX各組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。整體來看，KX 1h各血清濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于2h，其中KX1h20%濃度時(shí)，抑制效果明顯優(yōu)于KX2h20%濃度，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 1h、2h復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清(BJ)對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表2顯示，BJ各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無(wú)論1h還是2h抽血，BJ各組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。從數(shù)值上來看，存在BJ 2h各血清濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制效果高于1h的趨勢(shì)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 服藥后1h采血，2種藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表3顯示，各治療組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明2種藥物血清對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。服藥后1h，KX在10%、5%濃度較BJ抑制作用強(qiáng)，其中5%濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 服藥后2h采血，2種藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表4顯示，各治療組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明2種藥物血清對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。服藥后2h，BJ在3個(gè)濃度點(diǎn)上均較KX抑制作用強(qiáng)，其中20%、10%濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 服藥后1hKX、BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表4 服藥后2hKX、BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.5 增加0.5h抽血時(shí)間點(diǎn)后KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表5顯示，KX各組與MEM組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明KX各組對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用。KX 0.5h各濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制效果均明顯高于2h，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度KX對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.6 0.5h的KX與2h的BJ對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

表6顯示，整體來看，KX 0.5h各血清濃度對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制效果強(qiáng)于BJ2h，其中KX0.5h40%濃度時(shí)抑制效果明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;BJ各組與同濃度服藥前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

藥物血清一直以來都是體外研究的重要手段之一，既往藥物血清主要來源于動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物血清的采血時(shí)間點(diǎn)也有專門的研究［2］。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸意識(shí)到實(shí)驗(yàn)用材料的種屬問題［3］，它包括兩個(gè)層面的意義:一是種屬一致。應(yīng)該使用同種動(dòng)物的藥物血清作用于同種動(dòng)物的細(xì)胞，避免與實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的因素干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果;二是種屬相近。目前體外實(shí)驗(yàn)多采用人來源的細(xì)胞，即應(yīng)當(dāng)采用最接近人體的實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能夠最大限度的接近實(shí)際。但藥物血清多數(shù)還是來源于動(dòng)物，在人的細(xì)胞上添加動(dòng)物血清作為刺激因素，存在不合理性。也有報(bào)道，采集人血清進(jìn)行藥物血清實(shí)驗(yàn)，也存在一定的問題，多數(shù)中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)不明，統(tǒng)一的采血時(shí)間點(diǎn)不能保證2種以上不同藥物在采血時(shí)均已達(dá)到該藥的峰值，藥物劑型不同，吸收代謝也不同。

表6 0.5h的KX與2h的BJ對(duì)Hep G2人肝癌細(xì)胞增殖活性的影響(作用48h)

本實(shí)驗(yàn)選取2種藥物劑型，即湯劑和中成藥片劑，兩者藥物成分不同。健康志愿者3名，且3人的藥物血清不混合，測(cè)試2種藥物服用后不同時(shí)間點(diǎn)采集的藥物血清對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，2種藥物血清對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞均有增殖抑制作用，中藥湯劑KX的抑制作用隨著抽血時(shí)間的延長(zhǎng)而遞減，其中0.5h抽血點(diǎn)各濃度藥物血清的抑制作用明顯較2h強(qiáng)(P<0.05);中成藥片劑BJ藥物血清的抑制效果則相反，存在2h比1h強(qiáng)的趨勢(shì);在同一采血時(shí)間點(diǎn)或不同采血時(shí)間點(diǎn)上比較，2種藥物血清的抑制效果存在不同，甚至相反。研究表明，不同藥物在體內(nèi)的代謝時(shí)間不同，在采用人來源藥物血清實(shí)驗(yàn)時(shí)需要注意，選取對(duì)照藥時(shí)應(yīng)選取2種藥物作用都較強(qiáng)的時(shí)候進(jìn)行比較，切實(shí)反映藥物療效。本實(shí)驗(yàn)由于未設(shè)0.5hBJ，在以后的實(shí)驗(yàn)中我們將做進(jìn)一步完善。

［1］ 葉永安，朱陵群.中藥復(fù)方血清藥理學(xué)在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用的思考［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7(5):323-324.

［2］ 李儀奎.中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的若干問題［J］.中藥新藥與臨床藥理，1999，10(2):95-98.

［3］ 吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理實(shí)驗(yàn)中異種動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和滅活后的減毒作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2000，16(1):118-119.