潘靜華，張海嘯，2，李芳芳，尹智煒，李 恩

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬廈門第一醫(yī)院，福建廈門 361003;2.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700;3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，石家莊 050017)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是絕經(jīng)后婦女常見代謝性骨病，其特征是骨量減少、骨組織的顯微結(jié)構(gòu)改變，骨折的危險性加大。據(jù)預(yù)測，我國原發(fā)性骨質(zhì)疏松人數(shù)約為8800萬人，約占人口總數(shù)的6.97%。在我國女性60歲以上、男性75歲以上都患有不同程度的骨質(zhì)疏松［1］。骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為威脅老年人健康的重大問題之一。

骨質(zhì)疏松的發(fā)病率以絕經(jīng)后婦女人群為最高，可達(dá)50%以上，其主要原因是體內(nèi)雌激素水平迅速降低，引起骨吸收相對增加，導(dǎo)致高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的發(fā)生。大鼠去卵巢后所發(fā)生的骨丟失與絕經(jīng)引起的骨丟失有許多共同之處，該模型已廣泛用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松防治藥物的篩選及療效的評價［2、3］。

當(dāng)前西藥治療骨質(zhì)疏松常采用激素替代治療抑制高轉(zhuǎn)換型骨代謝和二磷酸鹽抑制骨吸收為主。但是由于雌激素(E2)可增加患子宮癌和乳腺癌的危險性、阿侖磷酸鈉(ALN)對胃腸道的副作用，限制了臨床的應(yīng)用。因而在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，從天然植物藥中尋找有效的治療藥物或有效成分已成為關(guān)注的熱點。已有的研究結(jié)果表明，補益類中藥在骨質(zhì)疏松的防治中占有重要的地位，達(dá)70%以上［4］。黃芪為補藥之長，能“助氣壯筋骨，長肉補血，實皮毛”。在臨床中常用于脾氣不足型骨質(zhì)疏松的治療，文獻(xiàn)研究顯示其在抗骨質(zhì)疏松復(fù)方中應(yīng)用的頻率較高［4］。實驗研究已經(jīng)證實，黃芪對骨質(zhì)疏松的防治作用確切，但是其對去卵巢大鼠骨組織的動態(tài)影響尚未見報道。

1 材料

黃芪生藥切片購于石家莊市樂仁堂藥材公司;尼爾雌醇由北京四環(huán)制藥廠生產(chǎn)，批號20010801;堿性磷酸酶測定試劑盒由石家莊試劑公司生產(chǎn);抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒為南京建成生物試劑公司產(chǎn)品;血鈣測定試劑盒為首都醫(yī)科大學(xué)科技中心生產(chǎn);血磷測定試劑盒由石家莊試劑公司生產(chǎn)，其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

2 方法

2.1 動物模型的建立、分組和處理

6月齡SD雌性大鼠64只，購自同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號020509。大鼠平均體重為256g±31g，隨機分為4組，即假手術(shù)組(Sham組)、卵巢切除組(OVX組)、卵巢切除 +黃芪組(HSW組)、卵巢切除 +尼爾雌醇組(E2組)，每組16只。動物麻醉后摘除雙側(cè)卵巢，Sham組切除同樣大小的脂肪。各組大鼠于卵巢切除30d后開始灌胃給藥，黃芪(1.8g/kg·d)、E2(0.1mg/kg，每周 2次)、Sham組與OVX組給予等量蒸餾水灌胃。于給藥后第15天將各組半數(shù)動物取血后處死。

2.2 中藥的制備

將黃芪生藥切片加3倍量蒸餾水浸潤4h，煮沸回流1.5h過濾，再加3倍量蒸餾水煮沸回流、過濾2次，合并3次濾液濃縮至0.18g/ml。

2.3 血清ALP和TRAP的測定

ALP采用氨基氨替吡啉酚法，TRAP采用對硝基苯磷酸二鈉法。

2.4 骨組織ALP和TRAP的測定

從－70℃取出骨標(biāo)本，分離右后股骨，去除股骨端軟骨盤和連接組織，剪取股骨近心端約1/3，用冰冷的檸檬酸緩沖液沖洗骨髓腔數(shù)次直至沖洗液無紅色為止，快速稱重后加檸檬酸緩沖液于研缽(置于冰盒中)中研磨，約0.5g骨組織加4mL檸檬酸緩沖液，組織研磨液離心(4℃ 12000r 10min)，上清液－70℃保存，用于測定ALP和TRAP，總蛋白測定應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法。

2.5 骨組織HOP、鈣、磷的測定

從－70℃取出骨標(biāo)本，分離右后脛骨，去除脛骨端軟骨盤和連接組織，剪取脛骨近心端約1/3，用雙蒸水沖洗骨髓腔數(shù)次直至沖洗液無紅色為止。于烤箱中80℃ 48h烘干、稱重。每份骨樣本加6mol/L HCl 3ml高溫(125℃)消化，消化液分成2等份，第1份消化液稀釋后用甲基麝香草酚蘭比色法測定鈣，采用鉬酸銨氧化法測定磷;第2份消化液采用改良的氯氨-T氧化法測定骨HOP，用骨鈣總量/骨干重比值、骨磷總量/骨干重比值作為骨礦物質(zhì)含量的指標(biāo)，用骨(HOP×12.5)/(骨干重×0.9)的值作為骨有機質(zhì)(bone organic)含量的指標(biāo)。

2.6 骨組織病理切片

4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣后，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片和HE染色，顯微鏡下觀察并照相，照相位置選擇股關(guān)節(jié)盤下10μm處。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)處理，參數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間比較用q檢驗。

3 結(jié)果

3.1 黃芪對骨有機質(zhì)和礦物質(zhì)的動態(tài)影響

表1顯示，與Sham組比較，2個階段OVX組的骨有機質(zhì)、骨磷相對含量明顯降低(P<0.05和P<0.001)，骨鈣在治療15d時出現(xiàn)一定的降低，但未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，在第30天時方出現(xiàn)明顯的降低(P<0.05)。同OVX組比較，E2組治療15d和30d時的骨有機質(zhì)、骨磷相對含量明顯升高(P<0.05和P<0.001)，HQ組的骨有機質(zhì)相對含量在30d時出現(xiàn)明顯增加(P<0.001)，骨磷相對含量在治療的15d和30d時均出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義的升高，但是骨鈣在2個藥物組、2個時間段中均沒有明顯改善。

表1 去卵巢大鼠骨組織中有機質(zhì)及礦物質(zhì)鈣、磷相對含量的變化(%，珋x±s)

3.2 黃芪對ALP的動態(tài)影響

表2顯示，與Sham組比較，第15天時OVX組血清ALP活性無明顯差異，而骨ALP活性升高(P<0.05);在第30天時OVX組血清和骨ALP活性均明顯升高(P<0.05)。HQ組同OVX組比較，治療15d時血清和骨組織ALP活性沒有出現(xiàn)明顯的改變，而在30d時出現(xiàn)明顯的增加(P<0.05)，而E2組未見到明顯的變化。

表2 去卵巢大鼠血清和骨組織中ALP的變化(IU/L，珋x±s)

3.3 黃芪對TRAP的動態(tài)影響

表3顯示，在2個治療階段 OVX組的血清TRAP活性與Sham組比較，無明顯變化，而骨TRAP活性明顯增加(P<0.05)。同OVX組比較，E2組治療30d時骨TRAP活性有明顯降低(P<0.05)，而HQ組的TRAP活性僅見到降低趨勢，無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 去卵巢大鼠血清和骨組織中TRAP的變化(IU/L，珋x±s)

3.4 大鼠股骨組織病理改變

圖1顯示，在治療第15天、30天時，均可見到OVX組股骨的骨小梁稀疏變薄，骨髓腔擴(kuò)大，可見到骨小梁斷裂，排列不整，且卵巢切除大鼠的骨組織稀疏狀態(tài)隨著時間的延長而加重。而黃芪和尼爾雌醇應(yīng)用后，骨小梁有所增厚，數(shù)目增加，骨小梁斷裂減少。

圖1 去卵巢大鼠用藥治療30d時的股骨組織形態(tài)圖片(×40)

4 討論

骨組織由骨的基本多細(xì)胞單位(BMU)，通過破骨-成骨(骨轉(zhuǎn)換)的偶聯(lián)活動，自我更新、重建。伴隨絕經(jīng)而來的雌激素不足，引起單位時間內(nèi)BMU數(shù)量增加，即骨轉(zhuǎn)換頻率增多，并且在每次骨轉(zhuǎn)換中，破骨多于成骨(失偶聯(lián))，骨代謝出現(xiàn)明顯負(fù)平衡，骨組織量減少加速。其病理變化主要表現(xiàn)為骨有機基質(zhì)和骨礦物質(zhì)的減少。骨有機質(zhì)中的主要成分是骨膠原纖維，即通常所說的骨膠原(bone collagen)，約占骨有機質(zhì)的90%。并且與膠原蛋白中羥脯氨酸含量相對一致，約占膠原氨基酸的12.5%左右，因此測定骨HOP含量可推知骨組織中有機質(zhì)的含量。骨礦物質(zhì)是由無定形的鈣磷混合物和鈣羥磷灰石晶體構(gòu)成。體內(nèi)鈣含量的99%存在于骨骼中，骨骼形成后，骨組織中的鈣并不是固定不變的。體內(nèi)磷的85%存在于骨中，其主要作用是促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和骨礦沉積。磷的釋放總伴隨骨的破壞，故測定鈣、磷的相對含量可推測骨中無機質(zhì)的狀況［5］。

當(dāng)破骨細(xì)胞活性占優(yōu)勢時，骨膠原和骨磷、鈣的量減少，當(dāng)成骨細(xì)胞活性占優(yōu)勢時，骨膠原和骨磷、鈣的量增加，因此骨膠原和骨磷、鈣的量可以靈敏地反映骨組織破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性的相對強弱［6、7］。在本試驗中我們觀察到，在去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨組織中，骨有機質(zhì)、骨礦物質(zhì)(鈣、磷)均隨時間的延長而呈進(jìn)行性減少。在用藥治療15d時的骨有機質(zhì)和骨磷升高，說明使用中藥黃芪可影響到骨組織，迅速改善骨有機質(zhì)和骨磷的含量，使骨丟失有所減少。并且在大鼠去卵巢后的早期階段，骨磷的改變快于骨鈣，可能與鈣鹽的代謝較慢有關(guān)。

綜合病理和骨有機質(zhì)和骨礦物質(zhì)的檢測結(jié)果來看，黃芪與尼爾雌醇具有相似的治療作用。然而，其作用機理是否也相似呢?由于在骨重建過程中，破骨細(xì)胞分泌酸和酶來溶解吸收舊骨，成骨細(xì)胞分泌酶和骨膠原等蛋白以助骨鈣沉積，生成新骨。TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶，其活性高低反映了破骨細(xì)胞活性的強弱，ALP是成骨細(xì)胞的標(biāo)志酶［8］，其活性高低反映成骨細(xì)胞活性的強弱。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，尼爾雌醇對TRAP活性的改變出現(xiàn)明顯抑制，而ALP活性并未見到明顯的改變;黃芪對血清和骨組織中成骨細(xì)胞的標(biāo)志酶ALP活性明顯增強，而僅見到降低TRAP活性的趨勢。這說明短期應(yīng)用尼爾雌醇主要抑制破骨細(xì)胞的活性，而黃芪主要促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性。

總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，黃芪能改善去卵巢大鼠骨有機質(zhì)和骨磷的減少，改善骨組織形態(tài)，隨著用藥時程的增加，對骨組織的改善作用更為明顯;增強ALP活性，尤其骨組織ALP活性可能是黃芪防治骨質(zhì)疏松的主要機理。

［1］ 樸俊紅，龐蓮萍，劉忠厚，等.中國人口狀況及原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)生率［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2002，8(1):1-7.

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［4］ 李芳芳，張海嘯.骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)復(fù)方用藥分析及單味藥研究進(jìn)展［J］.河北中醫(yī)藥學(xué)報，2004，19(2):37-40.

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