孫 科, 顏 天, 周名江, 何建宗

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院研究生院,北京 100039; 3. 香港公開大學(xué) 科技學(xué)院, 香港 999077)

米氏凱倫藻對(duì)褶皺臂尾輪蟲、鹵蟲和黑褐新糠蝦存活的影響

孫 科1,2, 顏 天1, 周名江1, 何建宗3

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院研究生院,北京 100039; 3. 香港公開大學(xué) 科技學(xué)院, 香港 999077)

初步研究了一株米氏凱倫藻對(duì)褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)、鹵蟲(Artemia salina)幼體和黑褐新糠蝦(Neomysis awatschensis)的毒性效應(yīng)和機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)在較低密度下就能明顯減少輪蟲的種群數(shù)量, 24 h EC50僅為20個(gè)/mL左右; 該藻的各組分毒性比較結(jié)果顯示,只有藻液和細(xì)胞重懸液有這種毒害作用, 而去藻過濾液和藻細(xì)胞破碎液的影響不明顯, 表明這種毒害作用可能是由于活的藻細(xì)胞引起的; 在米氏凱倫藻中鹵蟲和黑褐新糠蝦的存活數(shù)量也明顯下降。結(jié)果表明, 米氏凱倫藻赤潮可能通過直接影響存活從而對(duì)浮游動(dòng)物產(chǎn)生影響。

米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi); 褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis); 鹵蟲(Artemia salina);黑褐新糠蝦(Neomysis awatschensis); 種群數(shù)量; 存活

凱倫藻(Karenia sp.)作為一種世界廣布種, 在全球范圍內(nèi)多個(gè)沿海國家形成過赤潮[1], 該藻引發(fā)的魚毒性赤潮常常導(dǎo)致大量魚類和底棲生物的死亡[2～4]。在我國, 凱倫藻赤潮的發(fā)生呈現(xiàn)出由南向北不斷擴(kuò)大的趨勢[5～7], 其中兩次較為嚴(yán)重的凱倫藻赤潮分別發(fā)生在1998年的香港海域和2005年的浙江沿海, 分別給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了3.5億元和2000萬元的直接經(jīng)濟(jì)損失[7,8]。除能夠?qū)︳~類、貝類等較大生物產(chǎn)生危害, 米氏凱倫藻赤潮還能對(duì)中華哲水蚤等浮游動(dòng)物產(chǎn)生不利影響[9]。

海洋浮游動(dòng)物能夠攝食浮游植物, 又能夠被更高營養(yǎng)級(jí)的海洋生物所攝食, 它們?cè)谏鷳B(tài)系統(tǒng)中起著承上啟下的重要作用, 可見, 赤潮對(duì)浮游動(dòng)物的影響將會(huì)間接擴(kuò)大為對(duì)整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響,且赤潮藻能夠通過多種方式與機(jī)制對(duì)浮游動(dòng)物造成影響[10]。因此, 開展米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)對(duì)海洋浮游動(dòng)物影響的研究具有重要的意義。輪蟲個(gè)體小, 生命周期短, 實(shí)驗(yàn)室易培養(yǎng); 鹵蟲卵可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行孵化而得到大量的均勻個(gè)體, 且它們可以直接濾食和接觸有害藻; 黑褐新糠蝦(Neomysis awatschensis)是廣泛分布于我國沿海的一種小型甲殼生物。近年來, 輪蟲、鹵蟲和黑褐新糠蝦已被廣泛應(yīng)用于有害赤潮藻的毒性研究中[11～20]。因此, 作者以褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)、鹵蟲(Artemia salina)幼體、黑褐新糠蝦模擬不同大小的海洋浮游動(dòng)物, 針對(duì)米氏凱倫藻對(duì)其種群數(shù)量和存活的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究, 并初步分析了米氏凱倫藻赤潮對(duì)浮游動(dòng)物的危害機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試褶皺臂尾輪蟲由中國科學(xué)院海洋研究所培養(yǎng)中心提供, 為實(shí)驗(yàn)室常年培養(yǎng)種。實(shí)驗(yàn)用鹵蟲幼體為低溫保藏鹵蟲卵經(jīng)海水孵化得到的無節(jié)幼體(instarⅡ-), Ⅲ鹵蟲卵產(chǎn)自青海尕海湖。黑褐新糠蝦于1995年采集自膠州灣西海岸, 在中國科學(xué)院海洋研究所進(jìn)行了多年多代連續(xù)培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)所用的米氏凱倫藻分離于南海, 由暨南大學(xué)提供。實(shí)驗(yàn)用藻使用3 L錐形瓶以f/2培養(yǎng)液純種培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度(20±1), ℃光暗比為14L∶10D。小球藻(Chlorella sp.)由中國科學(xué)院海洋研究所藻種中心提供, 以小球藻培養(yǎng)液培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度(20±1), ℃光暗比12L∶12D?？肺r實(shí)驗(yàn)海水取自青島膠州灣外太平角無污染海水, 使用前經(jīng)沉淀沙濾, 用于藻類培養(yǎng)與輪蟲、鹵蟲實(shí)驗(yàn)的海水經(jīng) 0.45 μm混合纖維濾膜過濾和高溫滅菌, 鹽度用ATAGO手提式鹽度計(jì)測定, 通過加蒸餾水來調(diào)節(jié)。

1.2 方法

1.2.1 米氏凱倫藻對(duì)輪蟲的影響實(shí)驗(yàn)

輪蟲實(shí)驗(yàn)容器為50 mL燒杯, 實(shí)驗(yàn)體積為30 mL,實(shí)驗(yàn)溫度為(20±1)℃, 實(shí)驗(yàn)中鹽度調(diào)節(jié)至31±1。取指數(shù)生長中期的米氏凱倫藻用0.5 mL計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)后以海水稀釋, 使實(shí)驗(yàn)液藻細(xì)胞密度分別達(dá)到5、10、20、40、80個(gè)/mL, 實(shí)驗(yàn)前輪蟲饑餓12 h, 之后用80 μm篩絹濃縮并以藻培養(yǎng)液和海水稀釋, 使輪蟲最終密度為10個(gè)/mL。以投喂小球藻(投喂小球藻終密度約為 104個(gè)/mL) 為對(duì)照, 另設(shè)以消毒海水為實(shí)驗(yàn)液的饑餓組, 每組3個(gè)平行, 24 h記錄輪蟲存活數(shù)量。

1.2.2 米氏凱倫藻不同組分對(duì)輪蟲的影響實(shí)驗(yàn)

(1)藻培養(yǎng)液： 取指數(shù)生長中期米氏凱倫藻, 用0.5 mL計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)。(2)藻細(xì)胞重懸液：將藻培養(yǎng)液經(jīng)10μm篩絹過濾濃縮后, 用海水將藻細(xì)胞重新懸浮。(3)藻培養(yǎng)液過濾液：將(2)中過濾液再經(jīng)雙層濾紙過濾, 鏡檢無藻細(xì)胞。(4)藻細(xì)胞破碎液：將(2)中的藻細(xì)胞重懸液混勻, 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將藻細(xì)胞打碎。將以上新鮮制備的各種組分以海水稀釋到藻細(xì)胞密度是或相當(dāng)于 1 000個(gè)/mL, 以投喂小球藻(密度約為104個(gè)/mL)為對(duì)照, 另設(shè)以消毒海水為實(shí)驗(yàn)液的饑餓組, 每組3個(gè)平行, 24 h記錄輪蟲種群數(shù)量。

1.2.3 米氏凱倫藻對(duì)鹵蟲存活的影響實(shí)驗(yàn)

鹵蟲實(shí)驗(yàn)容器為12孔板, 實(shí)驗(yàn)體積為5 mL, 實(shí)驗(yàn)溫度為(20±1), ℃鹽度為31±1。取指數(shù)生長中期米氏凱倫藻用0.5 mL計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)后以海水稀釋, 使藻細(xì)胞密度分別達(dá) 100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、15 000個(gè)/mL, 分別加至12孔板中, 每孔放入大小較為均一的鹵蟲無節(jié)幼體10尾。對(duì)照組投喂處于指數(shù)增長期的小球藻(密度為 106個(gè)/mL), 以海水為饑餓組, 每組3個(gè)平行。每隔24 h觀察記錄各組中鹵蟲存活數(shù)(以解剖針觸動(dòng)鹵蟲, 5 s內(nèi)觸角不動(dòng)作為死亡標(biāo)準(zhǔn)), 加入適量蒸餾水調(diào)節(jié)鹽度, 48 h更換實(shí)驗(yàn)液, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行96 h。

1.2.4 米氏凱倫藻對(duì)黑褐新糠蝦存活的影響實(shí)驗(yàn)

黑褐新糠蝦實(shí)驗(yàn)容器為500 mL燒杯, 實(shí)驗(yàn)體積為400 mL, 實(shí)驗(yàn)溫度為(20±1),℃ 鹽度為31±1, 取指數(shù)生長中期米氏凱倫藻用0.5 mL計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)后以海水稀釋, 使藻細(xì)胞密度分別達(dá)到 2 000、5 000、10 000、15 000個(gè)/mL。選取(5±1)日齡健康活潑幼蝦隨機(jī)放入配制好的實(shí)驗(yàn)液中, 每杯10尾。以海水作為對(duì)照, 每組3個(gè)平行。每24 h投喂適量鹵蟲幼體, 吸取死蝦和杯底污物, 并記錄糠蝦的存活數(shù), 每48 h換一次處理液, 實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行16 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel中的STDEV以及TTEST等函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 米氏凱倫藻對(duì)輪蟲種群數(shù)量的影響

米氏凱倫藻對(duì)褶皺臂尾輪蟲種群數(shù)量的影響如圖1所示。24 h時(shí), 對(duì)照組的輪蟲種群數(shù)量有所增加,饑餓組中輪蟲種群數(shù)量仍維持在起始狀態(tài)。其他各密度組的輪蟲種群數(shù)量均有一定程度的下降, 而且隨著米氏凱倫藻藻細(xì)胞密度升高, 輪蟲種群數(shù)量降低程度越明顯, 至 20個(gè)/mL時(shí), 輪蟲種群數(shù)量與饑餓組有顯著差異(P＜0.05), 當(dāng)藻細(xì)胞密度達(dá)到40個(gè)/mL和80個(gè)/mL時(shí), 輪蟲種群數(shù)量與饑餓組有極顯著差異(P＜0.01)。米氏凱倫藻對(duì)輪蟲的24 h EC50約為 20個(gè)/mL。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見, 米氏凱倫藻藻細(xì)胞對(duì)輪蟲具有很強(qiáng)的毒性作用。

圖 1 不同密度米氏凱倫藻對(duì)輪蟲種群數(shù)量的影響(CT：對(duì)照; SV：饑餓)Fig. 1 The effect of K. mikimotoi on rotifer B. plicatilis population (CT： control; SV： starvation)

2.2 米氏凱倫藻不同組分對(duì)輪蟲種群數(shù)量的影響

為了探明米氏凱倫藻對(duì)輪蟲的毒性來源, 作者比較了藻的各組分：藻培養(yǎng)液、藻細(xì)胞重懸液、藻培養(yǎng)液過濾液、藻細(xì)胞破碎液對(duì)輪蟲種群數(shù)量的影響。由圖2可見, 24 h后藻的各組分中只有藻液和藻細(xì)胞重懸液使輪蟲種群數(shù)量顯著降低(P＜0.01), 分別減少了 98%和 85%, 其他組分中的輪蟲種群數(shù)量與饑餓組無顯著性差異。看來只有完整的活藻細(xì)胞(藻培養(yǎng)液和藻細(xì)胞重懸液) 才具有對(duì)輪蟲的急性致死效應(yīng), 因此該藻的毒性可能與藻細(xì)胞活性有關(guān)。

圖2 米氏凱倫藻不同組分對(duì)輪蟲種群數(shù)量的影響Fig. 2 The effect of different fractions on rotifer B. plicatilis populationA.對(duì)照; B.饑餓; C.藻培養(yǎng)液; D.藻細(xì)胞重懸液; E.藻培養(yǎng)液過濾液; F.藻細(xì)胞破碎液A. Control; B. Starvation; C. Algal culture; D. Re-suspended algal cells; E. Filtrate; F. Broken cells

2.3 米氏凱倫藻對(duì)鹵蟲存活的影響

米氏凱倫藻對(duì)鹵蟲存活的影響如圖3所示。24 h,各實(shí)驗(yàn)組中鹵蟲的存活率均在90%以上; 48 h后除對(duì)照組外, 其他各組中的鹵蟲存活率都呈現(xiàn)下降的趨勢, 且各藻密度組中鹵蟲的存活率與饑餓組之間沒有顯著性差異, 說明在僅有米氏凱倫藻存在的條件下鹵蟲不能存活, 饑餓可能是造成其死亡的原因。在實(shí)驗(yàn)中觀察到高密度組中鹵蟲被黏性物質(zhì)纏在一起, 不能自由運(yùn)動(dòng), 藻細(xì)胞外黏液及毒性物質(zhì)可能也是導(dǎo)致鹵蟲死亡的原因。

圖3 米氏凱倫藻對(duì)鹵蟲存活的影響Fig. 3 The effect of K. mikimotoi density on brine shrimp A.salina

2.4 米氏凱倫藻對(duì)黑褐新糠蝦存活的影響

米氏凱倫藻對(duì)黑褐新糠蝦存活的影響如圖 4所示。16 d時(shí), 糠蝦的存活率隨藻細(xì)胞密度的增加而下降, 在低密度(＜5 000個(gè)/mL)下糠蝦的存活率為100%, 而在10 000、15 000個(gè)/mL密度下, 糠蝦的存活率分別為77%和27%, 其中15 000個(gè)/mL密度中的糠蝦存活率與對(duì)照組有極顯著的差異(P＜0.01)。米氏凱倫藻對(duì)糠蝦的16 d半致死密度(16 d LD50) 約為12 500個(gè)/mL。

圖4 米氏凱倫藻對(duì)黑褐新糠蝦存活的影響Fig. 4 The effect of K. mikimotoi density on Neomysis awatschensis

3 討論

3.1 米氏凱倫藻赤潮對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害

一般認(rèn)為米氏凱倫藻赤潮的危害有以下三種途徑： 首先, 在赤潮發(fā)生時(shí)藻細(xì)胞夜間呼吸以及在赤潮消退期藻細(xì)胞分解會(huì)消耗大量氧氣, 產(chǎn)生低氧環(huán)境; 其次, 米氏凱倫藻能產(chǎn)生溶血毒素、魚毒素[21,22]、活性氧[25]及部分細(xì)胞毒素[24,25]等; 再次, 米氏凱倫藻赤潮發(fā)生時(shí)海水中存在黏液性物質(zhì)或者泡沫[2,26～28],Partensky[29]認(rèn)為由此造成的海水黏滯性增加是導(dǎo)致海洋生物死亡的主要原因。

當(dāng)米氏凱倫藻赤潮爆發(fā)時(shí), 人們一般只關(guān)注其造成的魚類等個(gè)體較大生物的死亡, 而根據(jù)本研究的結(jié)果, 2×104個(gè)/L密度的米氏凱倫藻24 h就能導(dǎo)致輪蟲數(shù)量減少一半, 且韓剛等[9]在現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),米氏凱倫藻赤潮能夠顯著降低中華哲水蚤的數(shù)量,相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)凱倫藻能導(dǎo)致沙蠶、牡蠣幼體和鮑魚幼體的死亡, 抑制扇貝受精卵分裂并導(dǎo)致其胚胎發(fā)育異常等[21,26,30～32]。因此可以推測, 在米氏凱倫藻赤潮發(fā)生時(shí), 某些浮游動(dòng)物可能已經(jīng)會(huì)出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。因此, 凱倫藻赤潮對(duì)浮游動(dòng)物的種群數(shù)量,以及整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的負(fù)面影響也值得關(guān)注。

3.2 不同生物對(duì)米氏凱倫藻敏感性的比較

本實(shí)驗(yàn)中 3種生物對(duì)于米氏凱倫藻的敏感性差異非常明顯。其中輪蟲最為敏感, 然后依次為鹵蟲和糠蝦。24 h輪蟲數(shù)量和藻細(xì)胞密度對(duì)數(shù)值間的線性方程為： y = -6.367x + 13.684, R2= 0.902 6, 以此計(jì)算,當(dāng)暴露于2 000個(gè)/mL的米氏凱倫藻中時(shí), 24 h內(nèi)輪蟲將全部死亡。而在此密度下, 24 h內(nèi)鹵蟲的存活率為100%, 96 h后才大量死亡。黑褐新糠蝦在2 000個(gè)/mL的米氏凱倫藻中卻能夠存活至少 16 d, 當(dāng)密度達(dá)到10 000個(gè)/mL時(shí)才出現(xiàn)死亡。敏感性的差異可能是由于它們具有不同的生理結(jié)構(gòu)、代謝途徑和攝食方式等造成的。

有學(xué)者指出甲藻對(duì)褶皺臂尾輪蟲的毒害作用是由于藻細(xì)胞和輪蟲之間發(fā)生頻繁碰撞而影響了輪蟲體內(nèi)某些生理功能, 并刺激了藻細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放[33,34]。Zou等[35]在研究一株米氏凱倫藻時(shí)也發(fā)現(xiàn)該藻藻細(xì)胞對(duì)褶皺臂尾輪蟲具有急性致死作用, 當(dāng)藻細(xì)胞與輪蟲之間的直接接觸被阻斷時(shí), 這種毒性作用會(huì)隨之消失, 且藻培養(yǎng)液過濾液與藻細(xì)胞破碎液不具有這種毒性作用, 說明完整藻細(xì)胞的直接接觸是導(dǎo)致輪蟲死亡的關(guān)鍵因素; 通過化學(xué)方法去除藻細(xì)胞可能含有的活性氧后, 毒性作用仍然存在,且該藻對(duì)輪蟲的毒性作用與其溶血活性具有一定的相關(guān)性, 說明這種毒性作用與活性氧無關(guān), 其可能與溶血活性有關(guān); 他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到, 當(dāng)暴露在米氏凱倫藻藻細(xì)胞中, 部分輪蟲的頭冠會(huì)被黏性分泌物包裹并出現(xiàn)泡沫狀結(jié)構(gòu)。綜上所述, 他們認(rèn)為米氏凱倫藻對(duì)褶皺臂尾輪蟲的毒性作用可能是由于直接接觸造成了頭冠等敏感部位膜結(jié)構(gòu)的損傷。鹵蟲是一種鰓足類甲殼生物, 它的鰓裸露位于附肢基部,容易受到米氏凱倫藻產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的毒害。雖然米氏凱倫藻中鹵蟲存活率的下降趨勢與饑餓組相似,但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹵蟲能夠攝食米氏凱倫藻, 藻細(xì)胞可能給鹵蟲提供部分營養(yǎng), 可能由于藻細(xì)胞提供營養(yǎng)不足, 或者在攝入藻細(xì)胞的同時(shí)攝入了某些有害物質(zhì)而導(dǎo)致鹵蟲死亡, 高密度藻細(xì)胞產(chǎn)生的黏性物質(zhì)也可能是導(dǎo)致鹵蟲死亡的原因。黑褐新糠蝦雖不攝食藻細(xì)胞, 但由于鹵蟲能夠攝食米氏凱倫藻, 毒性物質(zhì)可能通過鹵蟲的傳遞或在糠蝦捕食和吞水過程中進(jìn)入糠蝦體內(nèi), 從而對(duì)其產(chǎn)生毒性影響。在今后的實(shí)驗(yàn)中, 作者將使用雙殼貝類和魚類等作為受試生物,使研究結(jié)果更充分地反映出有害赤潮可能對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)各種生物造成的影響。致謝： 本實(shí)驗(yàn)得到了中國科學(xué)院海洋研究所張利永博士在藻類培養(yǎng)方面的指導(dǎo), 以及湯士英和別煥章師傅在生物培養(yǎng)方面的大力協(xié)助, 在此一并致以謝忱。

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Effect of Karenia mikimotoi on the survival of rotifer Brachionus plicatilis, brine shrimp Artemia salina, and Neomysis awatschensis

SUN Ke1,2, YAN Tian1, ZHOU Ming-jiang1, Ho KC3
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate School, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China; 3. School of Science and Technology, The Open University of Hong Kong, Hong Kong 999077)

Mar., 25, 2010

Karenia mikimotoi; Brachionus plicatilis; Artemia salina; Neomysis awatschensis; population; survival

In this paper, we analyzed the distribution of blooms caused by Karenia sp. in China and the toxicity of Karenia mikimotoi to Brachionus plicatilis, Artemia salina, and Neomysis awatschensis. The population of B. plicatilis was significantly decreased when exposed to K. mikimotoi at low densities and the 24h EC50was about 20 cells/mL. Comparison of the toxicities of different algal fractions showed that the algal culture and re-suspended algal cells had the adverse effects, but the broken cells and filtrate showed little impact, indicating that the inhibitory effect was mainly related to the active whole algal cells. The survival of A. salina or N. awatschensis was significantly decreased when exposed to K. mikimotoi. The results suggest that K. mikimotoi blooms might directly impact zooplankton survival.

S963.14

A

1000-3096(2010)09-0076-06

2010-03-25;

2010-06-12

中國科學(xué)院創(chuàng)新項(xiàng)目(KZCX2-YW-208); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U0733006); 國家 973計(jì)劃項(xiàng)目(2010CB428700)

孫科(1985-)男, 山東淄博人, 碩士研究生, 研究方向：海洋生態(tài)學(xué), E-mail： sunke20021@126.com; 顏天, 通信作者, 主要從事赤潮危害機(jī)制研究, E-mail： tianyan@qdio.ac.cn

(本文編輯： 梁德海)