高效液相色譜法測(cè)定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量

賀云彪 劉軍 伍良知

當(dāng)歸養(yǎng)血丸由當(dāng)歸、白芍、地黃和黃芪等10味藥組成，收載于《中國(guó)藥典2005年版版一部》［1］。具益氣養(yǎng)血調(diào)經(jīng)功效，臨床用于治療氣血兩虛、月經(jīng)不調(diào)等病癥，療效顯著。法定標(biāo)準(zhǔn)中只收載了顯微鑒別項(xiàng)及當(dāng)歸、丹皮的薄層鑒別，無(wú)含量測(cè)定監(jiān)控指標(biāo)，不利于生產(chǎn)和使用相關(guān)部門控制其藥品質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸含量，并進(jìn)行了方法學(xué)研究，建立阿魏酸含量限度，以便更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)HP公司)，TU-1900紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司)，Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(大連伊利特科學(xué)儀器有限公司)。藥材購(gòu)自湖南省藥材有限責(zé)任公司;阿魏酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110773-200612，供含量測(cè)定用);甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。當(dāng)歸養(yǎng)血丸(自制，批號(hào)分別為:090820，090825，090830，091008，091011，091014)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-1%冰乙酸溶液(25:75);檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm;柱溫:25℃;流速:1.0 ml/min。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取阿魏酸對(duì)照品，加70%甲醇制成每約含10 μg/ml的溶液，以70%甲醇為空白，在400～200 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果表明阿魏酸的最大吸收峰為320 nm，且干擾少，故選擇320 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外掃描圖譜見圖1。

圖1 阿魏酸紫外掃描圖

2.3 供試品溶液制備方法的選擇

2.3.1 取本品約5 g，精密稱定，加入硅藻土5 g，研細(xì)，置索氏提取器中，加入70%甲醇100 ml，提取5 h，提取液減壓濃縮至約2 ml，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻。

2.3.2 取本品約5 g，精密稱定，加入硅藻土5 g，研細(xì)，置索氏提取器中，加入乙酸乙酯100 ml，提取5 h，提取液減壓濃縮至約2 ml，殘留物用流動(dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻。結(jié)果見表1。

表1 提取方法考察結(jié)果

結(jié)果表明用70%甲醇索氏提取的含量比用乙酸乙酯索氏提取高，故選擇70%甲醇索氏提取的作為本品的提取方法。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成12 μg/ml的溶液，即得。

2.5 干擾試驗(yàn) 取陰性對(duì)照樣品(缺當(dāng)歸)照供試品制備方法制備陰性樣品溶液。取阿魏酸對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果表明陰性對(duì)照對(duì)本品的測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見圖2。

圖1 陰性樣品(A)、對(duì)照品(B)和供試品(C)色譜圖1.阿魏酸

2.6 線性關(guān)系考查 精密吸取濃度為12 μg/ml的阿魏酸對(duì)照品溶液 2.5、5、10、15、20、40 μl注入液相色譜儀，記錄其峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Y=38485 x+567.34，r=0.999 7。結(jié)果表明，阿魏酸在0.030～0.480 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，其峰面積RSD為0.98%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液10 μl，每隔4 h進(jìn)樣測(cè)定一次，共測(cè)定6次。結(jié)果峰面積RSD為0.64%，表明阿魏酸在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品5份，按“2.3”項(xiàng)下制得供試品溶液并測(cè)定阿魏酸含量，結(jié)果平均含量為0.052 mg/g，RSD 為1.64%。

2.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量為0.052 mg/g(批號(hào):090820)的樣品約2.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液(0.12 mg/g)1.0 ml，按含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果阿魏酸的平均回收率為98.90%(n=6)，RSD 為1.97%，見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品測(cè)定 取當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品，按選定的方法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀。阿魏酸峰與樣品中其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，按阿魏酸峰計(jì)算，理論板數(shù)均在3000以上。6批當(dāng)歸養(yǎng)血丸阿魏酸含量結(jié)果見表3。

表3 6批樣品的阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

參考其他文獻(xiàn)［2，3，4］，流動(dòng)相的選擇曾考察甲醇-0.1% 磷酸不同比例，分離效果不甚理想;采用甲醇-1%冰乙酸溶液(25∶75)為流動(dòng)相，分離效果滿意，保留時(shí)間適中。

曾采用70%甲醇超聲、回流、索氏回流三種提取方法進(jìn)行比較，測(cè)定結(jié)果表明，索氏回流提取5 h，樣品中阿魏酸已基本提取完全，故確立索氏回流為提取方法。本品為蜜丸，加入硅藻土共同研磨提取，可使溶劑分散均勻，提取完全。

當(dāng)歸養(yǎng)血丸制劑中為當(dāng)歸藥材細(xì)粉入藥，《中國(guó)藥典》2005年版一部當(dāng)歸項(xiàng)下阿魏酸的含量限度為0.05%［5］，根據(jù)6批樣品阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)藥典》當(dāng)歸藥材含量限度，暫定本品中阿魏酸含量不得低于0.03 mg/g。

［1］中華人民共和國(guó)藥典2005版.一部 ，2005:437.

［2］張玉愛，吳澤榕，鄭起平，等.HPLC測(cè)定養(yǎng)血當(dāng)歸軟膠囊中阿魏酸的含量.中成藥，2006，284(4):599-600.

［3］閆雪梅，趙慧萍，嚴(yán)紅.HPLC法測(cè)定通脈顆粒中阿魏酸的含量.中草藥，2003，34(3):230-231.

［4］植達(dá)詩(shī)，周穎，牟曉崟.HPLC法測(cè)定養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿中阿魏酸和芍藥苷的含量.中國(guó)藥事，2008，22(6):493-495.

［5］中華人民共和國(guó)藥典2005版.一部，2005:89.