劉明中，張清鳳，申志新，董 楊，王 吉，趙榮科

(海南熱帶海洋學(xué)院 a.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究所；b.海南現(xiàn)代海洋牧場(chǎng)工程研究中心； c.生態(tài)環(huán)境學(xué)院，海南 三亞 572022)

0 引言

索氏桃花水母是一種淡水水母，水母體直徑約20～25 mm。目前，人們已經(jīng)陸續(xù)在除南極洲外的世界各地發(fā)現(xiàn)了索氏桃花水母，尤其是在亞熱帶到溫帶地區(qū)[1]。索氏桃花水母不僅能夠存在于水族館、池塘和水庫(kù)等人工水體中[2-4]，也可在天然淡水生境，例如小溪、湖泊和河流中生存[5-6]。索氏桃花水母主要生活在中營(yíng)養(yǎng)到富營(yíng)養(yǎng)化環(huán)境[7]。通常，人們很難判斷這些水母是從其他地方新引入的，還是長(zhǎng)期存在于當(dāng)?shù)?，而只是新近才被發(fā)現(xiàn)的，抑或是原有種近期發(fā)生了大規(guī)模的擴(kuò)散[8]。

中國(guó)作為桃花水母分布最廣泛的國(guó)家之一[9-10]，從20世紀(jì)80年代起開(kāi)始在全國(guó)19個(gè)省均有發(fā)現(xiàn)淡水水母的報(bào)告，共記錄了18個(gè)新物種[11]。然而，F(xiàn)ritz等[8]分析了中國(guó)和其他地區(qū)的桃花水母的COX1和ITS基因序列，認(rèn)為這些“新物種”中的絕大多數(shù)都是索氏桃花水母。因此，包括Craspedacustakiatingi，Craspedacustachuxiogensis，Craspedacustakawaii，Craspedacustakuoi，Craspedacustasichuanensis和Craspedacustaziguiensis在內(nèi)的“新物種”，都是索氏桃花水母的不同地理群體。

然而，我國(guó)此前未曾有過(guò)任何在離岸島嶼的淡水中發(fā)現(xiàn)索氏桃花水母的報(bào)道，而關(guān)于索氏桃花水母的擴(kuò)散途徑也尚不完全明確。海南島不僅是中國(guó)第二大島嶼，更是中國(guó)完全處于熱帶的最大島嶼，豐富的熱帶雨林資源造就了島上發(fā)達(dá)的淡水生態(tài)系統(tǒng)[12]。由于與歐亞大陸隔有瓊州海峽，海南島上包括人類在內(nèi)的各類生物與歐亞大陸上的生物學(xué)分化與交流問(wèn)題一直是研究熱點(diǎn)[13]。本研究就所查文獻(xiàn)，也未見(jiàn)國(guó)內(nèi)在海島上發(fā)現(xiàn)索氏桃花水母的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)

大王嶺水庫(kù)位于海南島的儋州市蘭洋鎮(zhèn)，地理坐標(biāo)109°42′ E，19°28′ N，建于1975年，主要用于農(nóng)業(yè)灌溉和水產(chǎn)養(yǎng)殖，集水面積2.8 km2，庫(kù)容量3.87×106m3。

在2019年11月，課題組在海南儋州市大王嶺水庫(kù)發(fā)現(xiàn)有淡水水母并進(jìn)行取樣和現(xiàn)場(chǎng)拍照(圖1)，取樣后的水母?jìng)€(gè)體保存在無(wú)水乙醇中。

圖1 海南儋州大王嶺水庫(kù)淡水水母照片

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與DNA提取

樣品從大王嶺水庫(kù)中采得后保存于無(wú)水乙醇中，4 ℃保存。DNA的提取采用天根海洋動(dòng)物基因組試劑盒(https://www.tiangen.com/?productShow/t1/1/id/23.html)，提取后的DNA放于-20 ℃以備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.2 樣品COX1基因和ITS基因的序列擴(kuò)增與鑒定

COX1基因序列擴(kuò)增使用的引物采用COX1通用引物[14]，正向引物COX1F1：5′-TCAACCACCCACAAAGACATTGGCAC-3′，反向引物COX1R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。

COX1基因的PCR反應(yīng)總體系為50 μL，包括Taq酶，Mix緩沖液20 μL，10 μmol濃度的上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，濃度10 ng，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性40 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

ITS基因序列擴(kuò)增使用的引物根據(jù)鄒秀[15]設(shè)計(jì)的引物序列合成，正向引物ITSF1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′；反向引物ITSR1：5′-GGTAGTCTTGCCTGATCTGAGG-3′；PCR反應(yīng)為50 μL體系，包括Taq酶Mix緩沖液20 μL，10 μmol濃度的上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，濃度10 ng，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充至50 μL。ITS基因的序列PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃變性4 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送青島華大基因公司測(cè)序。經(jīng)過(guò)雙向測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)Contigexpress軟件校正拼接后，導(dǎo)出的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的桃花水母COX1基因和ITS基因進(jìn)行序列相似性比對(duì)；利用MEGA 5.0軟件計(jì)算序列間的相對(duì)遺傳距離，構(gòu)建鄰接系統(tǒng)樹(shù)(Neighbor-joining tree)。系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度由Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣地點(diǎn)環(huán)境特征

取樣時(shí)大王嶺水環(huán)境參數(shù)如表1所示。

表1 海南儋州大王嶺水庫(kù)采樣時(shí)水環(huán)境參數(shù)

本研究采樣時(shí)間為2019年11月。按照湖泊(水庫(kù))營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)評(píng)分法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]，從水環(huán)境參數(shù)上可知采樣時(shí)大王嶺水庫(kù)處于中營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)，尤其是葉綠素a濃度、總氮濃度和總磷濃度3個(gè)指標(biāo)，其中總氮濃度相對(duì)較高。但由于水庫(kù)有外源流水注入且取樣時(shí)水溫不高的原因，因此水體溶氧較高，濁度較低?？傮w上庫(kù)區(qū)水環(huán)境基本健康。

2.2 儋州桃花水母COX1與ITS基因序列分析

通過(guò)對(duì)儋州桃花水母COX1基因和ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了600 bp長(zhǎng)的COX1基因序列和701 bp長(zhǎng)的ITS基因序列。測(cè)序獲得了樣品COX1(GenBank序列號(hào)：MT884060.1)和ITS(GenBank序列號(hào)：MT737784)序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與GenBank中收錄的桃花水母COX1基因和ITS基因進(jìn)行序列相似性比對(duì)(表2、表3)，儋州的桃花水母與已知的索式桃花水母COX1基因序列(LN901194.1)相似度達(dá)99.66%，ITS基因序列與已知的索式桃花水母ITS基因序列(AY513628.1，AY513626.1)相似度達(dá)100%，綜合表明，海南儋州發(fā)現(xiàn)的淡水水母為索式桃花水母。

表2 基于COX1基因建立的不同地區(qū)索氏桃花水母的遺傳距離

表3 基于ITS基因建立的不同地區(qū)索氏桃花水母的遺傳距離

對(duì)樣品與其他索氏桃花水母進(jìn)行基于COX1基因的遺傳距離計(jì)算與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(圖2)發(fā)現(xiàn)，海南儋州的索氏桃花水母與其他索式桃花水母的遺傳距離保持在0.002～0.188之間。鄰接進(jìn)化樹(shù)顯示海南索氏桃花水母與美國(guó)索氏桃花水母聚為一支。

圖2 鄰接法構(gòu)建的海南儋州與其他地區(qū)索氏桃花水母的COX1區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

對(duì)樣品與其他索氏桃花水母進(jìn)行基于ITS基因的遺傳距離計(jì)算與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(圖3)發(fā)現(xiàn)，海南儋州的索氏桃花水母與其他索式桃花水母的遺傳距離保持在0.000～0.403之間。鄰接進(jìn)化樹(shù)顯示在ITS基因上海南索氏桃花水母與湖北索氏桃花水母聚為一支。

圖3 鄰接法構(gòu)建的海南儋州與其他地區(qū)索氏桃花水母的ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

3.1 索氏桃花水母的分子鑒定

部分研究對(duì)野外發(fā)現(xiàn)的索氏桃花水母進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，但總體上各地索氏桃花水母的形態(tài)學(xué)特征，例如觸手?jǐn)?shù)、傘徑等參數(shù)并不完全一致[15,17-18]，因此僅僅依靠形態(tài)鑒定的手段對(duì)桃花水母定種，存在一定的局限性?，F(xiàn)在已有越來(lái)越多研究通過(guò)分子生物學(xué)手段來(lái)進(jìn)行定種。對(duì)桃花水母的分子生物學(xué)鑒定，除了進(jìn)行基本的單個(gè)基因或基因組的序列測(cè)定之外，許多研究還對(duì)現(xiàn)有的各個(gè)桃花水母發(fā)現(xiàn)報(bào)道中發(fā)表的DNA序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。陶莎等[19]對(duì)采得水母樣品進(jìn)行COX1區(qū)、18S區(qū)和ITS區(qū)測(cè)序，首先將測(cè)得序列與GenBank上的已有序列進(jìn)行多序列比對(duì)，確定了采得的貴州福泉水母樣品為索氏桃花水母。此外，該研究還將樣本序列用來(lái)與這些GenBank上的索氏桃花水母序列進(jìn)行了基于鄰接法的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)采用不同單個(gè)基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，得到與該樣品聚類關(guān)系最近的索氏桃花水母樣品均有所不同；Hroudova等[20]對(duì)索氏桃花水母進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組注釋，在Craspedacustasowerbyi的轉(zhuǎn)錄組中確定了6個(gè)同源異形結(jié)構(gòu)域基因(Homeodomain)，這些基因主要在平衡囊、柄狀突起和神經(jīng)環(huán)等具有感覺(jué)和神經(jīng)活動(dòng)的結(jié)構(gòu)組織中表達(dá)，表明水螅水母的轉(zhuǎn)錄組中普遍含有豐富的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄基因，用于調(diào)節(jié)感覺(jué)和神經(jīng)功能；Fuentes等[21]193對(duì)4個(gè)智利的湖泊中的淡水水母樣品進(jìn)行了COX1基因測(cè)序并確定為索氏桃花水母，并對(duì)各樣品之間、以及與其他發(fā)表的索氏桃花水母COX1基因序列進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，初步闡明了智利樣品與其他地區(qū)樣品之間的進(jìn)化關(guān)系；而Zou等[22]則對(duì)發(fā)現(xiàn)自武漢的索氏桃花水母進(jìn)行了線粒體基因組測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行了基因注釋，包括基因識(shí)別和基因結(jié)構(gòu)注釋等，并構(gòu)建了索氏桃花水母和其他已發(fā)表的腔腸動(dòng)物線粒體基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)與索氏桃花水母在線粒體基因組的遺傳進(jìn)化上最近的物種是CubaiaAphrodite。Schifani等[23]報(bào)道了索氏桃花水母在意大利西西里島的發(fā)現(xiàn)，并對(duì)樣品進(jìn)行了線粒體COX1基因和核ITS基因的測(cè)序，并與其他索氏桃花水母的序列進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，確定了西西里島的樣品與世界其他樣品的遺傳學(xué)關(guān)系。類似的工作還有Fritz等[8]對(duì)在德國(guó)采得的桃花水母進(jìn)行的COX1基因和ITS基因測(cè)序，并將其與中國(guó)的Craspedacustasowerbyi和Craspedacustakiatingi樣品進(jìn)行序列比較和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)2個(gè)地方的桃花水母雖然形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，但序列相似度較高，并提出支持現(xiàn)有的4種桃花水母有效種分別為Craspedacustasinensis,Craspedacustasowerbyi，Craspedacustakiatingi和Craspedacustaziguiensis這一假說(shuō)；此外，Karaouzas等[24]對(duì)在希臘一條人工運(yùn)河中發(fā)現(xiàn)的索氏桃花水母進(jìn)行了COX1基因序列測(cè)定，并構(gòu)建了其與中國(guó)湖北(NC018537)和德國(guó)個(gè)體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)與湖北個(gè)體進(jìn)化關(guān)系較近。

綜上所述，大部分研究者對(duì)于當(dāng)?shù)匕l(fā)現(xiàn)的桃花水母，其關(guān)注點(diǎn)都集中在與其他地方個(gè)體之間的親緣關(guān)系。另外，對(duì)同一個(gè)體采用不同的單個(gè)基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)時(shí)，得到的與其他個(gè)體的親緣關(guān)系不盡相同。這一現(xiàn)象同樣發(fā)生在本研究的海南儋州的索氏桃花水母上。本研究認(rèn)為，對(duì)索氏桃花水母的遺傳進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育分析有賴于進(jìn)一步對(duì)各地個(gè)體進(jìn)行全基因組的序列測(cè)定和注釋，再以此探究各地桃花水母之間的親緣關(guān)系，能夠有效克服單個(gè)基因代表性有限的問(wèn)題。

3.2 索氏桃花水母的環(huán)境適應(yīng)性與生物入侵

有部分研究將索氏桃花水母定義為一個(gè)全球性入侵物種[7,9,23-26]。另?yè)?jù)文獻(xiàn)記載，雖然索氏桃花水母的首次發(fā)現(xiàn)是在倫敦[27]，但這一物種通常被認(rèn)為起源于中國(guó)[28]。對(duì)于海南島的索氏桃花水母是本地物種還是外來(lái)種，尚有待進(jìn)一步研究。此外，索氏桃花水母偏好富營(yíng)養(yǎng)化到中營(yíng)養(yǎng)化的淡水環(huán)境[7]，對(duì)水溫有著寬廣的適應(yīng)幅度[21]193，這樣的特點(diǎn)與本研究中大王嶺水庫(kù)的環(huán)境特征相近。然而也有研究表明索氏桃花水母對(duì)紫外線的耐受性非常有限[21]199，但海南島屬于光照充足的低緯度熱帶島嶼。因此，大王嶺水庫(kù)中的索氏桃花水母的紫外線耐受性是否存在特異性，有待進(jìn)一步研究。此外，海南島由于其淡水生態(tài)系統(tǒng)的獨(dú)立性，有大量豐富的本土物種，大王嶺水庫(kù)則擁有海南長(zhǎng)臀鮠(Cranoglanismultiradiatus)，子陵吻鰕虎魚(yú)(Rhinogobiusgiurinus)，海南似鱎(Toxabramishoudemeri)等本土物種，索氏桃花水母的存在是否會(huì)對(duì)這些物種產(chǎn)生影響，也值得進(jìn)一步研究。

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