孫翰昌,龐 敏,靳 濤

(重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,重慶永川402168)

斑馬魚(yú)(Danio rerio)是鯉科短擔(dān)尼爾屬的一種熱帶觀賞魚(yú)[1]。斑馬魚(yú)作為一種新型的脊椎模式生物,可以進(jìn)行大規(guī)模的正向基因飽和突變與篩選[2]。隨著斑馬魚(yú)基因組測(cè)序工程的完成,接著需要進(jìn)行的就是斑馬魚(yú)的基因功能組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組學(xué)的研究。較準(zhǔn)確地注釋斑馬魚(yú)基因組以及從整體上了解基因家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能對(duì)積極推動(dòng)基因功能研究具有重要意義。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast grow th factors,FGFs)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似的能促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的多肽家族,其成員主要分布在腦神經(jīng)、腎、卵巢、胎盤(pán)、肝臟、骨肌、睪丸、成纖維細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等組織和細(xì)胞[3],通過(guò)與細(xì)胞膜特異受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。FGF家族成員多數(shù)都具有一個(gè)N端信號(hào)肽,屬于典型的分泌型生長(zhǎng)因子,可被細(xì)胞分泌到胞外,以自分泌或者旁分泌形式發(fā)揮調(diào)控作用[4]。因此,研究FGF成員的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)對(duì)于研究其在生物體內(nèi)的分泌途徑,可以揭示它在胚胎發(fā)育、組織形成與修復(fù)、炎癥、血栓形成、腫瘤發(fā)生等生理及病理過(guò)程中的作用途徑。

本文利用分析準(zhǔn)確率較高的Signal P3.0[5]、TMHMM 2.0、Big.PI-Predictor和 Target P1.01四種軟件對(duì)斑馬魚(yú)FGF中分泌型蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè),并對(duì)其信號(hào)肽的特征進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料 用于分析的斑馬魚(yú)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因序列來(lái)源于NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù),斑馬魚(yú)FGF家族成員共26個(gè)。

1.2 方法 采用表1的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和軟件對(duì)斑馬魚(yú)FGF信號(hào)肽進(jìn)行分析。Signal P3.0軟件分析斑馬魚(yú)FGF的N端氨基酸序列,確定是否存在信號(hào)肽。Signal P3.0的預(yù)測(cè)結(jié)果采用分泌信號(hào)肽判別式：L=-918.235-123.455*(Smean)+1 983.44*(HMM)對(duì)上述預(yù)測(cè)值進(jìn)行判定,當(dāng)L值＞0,即表示該蛋白具有分泌信號(hào)肽[5];TMHMM 2.0軟件,對(duì)該序列的跨膜區(qū)進(jìn)行分析;利用Big-PI predictor對(duì)蛋白的GPI-錨定位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè);最后采用Target P1.1軟件預(yù)測(cè)靶標(biāo)肽段在亞細(xì)胞器中的分布和定位,進(jìn)一步確定該信號(hào)序列是否為穿膜信號(hào)肽。最后采用Signal P3.0軟件對(duì)信號(hào)肽N、H、C結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

表1 斑馬魚(yú)FGF信號(hào)肽分析涉及到的Internet資源

2 結(jié)果與分析

2.1 信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析 采用生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)26個(gè)斑馬魚(yú)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的N-末端信號(hào)肽、GPI錨定位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)以及分泌途徑進(jìn)行分析,研究結(jié)果顯示,26個(gè)斑馬魚(yú)FGF中有10個(gè)可能具有N-末端信號(hào)肽,均無(wú)GPI-錨定位點(diǎn),其中8個(gè)跨膜螺旋為0,2個(gè)均具有1個(gè)跨膜螺旋區(qū),并且10個(gè)信號(hào)肽序列均具有分泌途徑的信號(hào)肽(SP)。綜合分析,滿足具有可溶性分泌信號(hào)肽的蛋白有10個(gè),所占比例達(dá)到38.5%。

2.2 斑馬魚(yú)FGF信號(hào)肽特征分析 采用生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析20種氨基酸殘基在斑馬魚(yú)FGF分泌型蛋白信號(hào)肽中的出現(xiàn)頻率,結(jié)果如圖1所示。研究結(jié)果顯示,在組成信號(hào)肽的氨基酸中,非極性氨基酸出現(xiàn)的頻率最高(A 、L、P、V)占43.8%;其次是帶負(fù)電荷的氨基酸(D、E 、F、H 、I、T 、M 、W 、Y)占23.5%;極性氨基酸(G 、N 、Q 、S)為 21.2%;出現(xiàn)頻率最低的是帶正電荷的堿性氨基酸(R、K)占7.1%。20種氨基酸的出現(xiàn)頻率從高到低為L(zhǎng)→A→S→V→C→T→G→M →R→F→P→W→Q→I→K→Y→E→N→H→D,其中亮氨酸(L)出現(xiàn)的頻率最高,為 19%,天冬氨酸(D)出現(xiàn)的頻率最低為0.3%(圖1)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸等脂肪族氨基酸的使用頻率都大于5%,這可能與信號(hào)肽的功能相關(guān),使其更易穿過(guò)質(zhì)膜。

圖1 斑馬魚(yú)FGF分泌蛋白信號(hào)肽中氨基酸的使用頻率

斑馬魚(yú)FGF分泌蛋白及信號(hào)肽長(zhǎng)度,見(jiàn)表2,分泌蛋白長(zhǎng)度變化范圍為187至258個(gè)氨基酸之間,平均為212個(gè)氨基酸,信號(hào)肽長(zhǎng)度變化范圍為17至39個(gè)氨基酸,平均為30個(gè)氨基酸。信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)基本相似,而信號(hào)肽長(zhǎng)度的變化說(shuō)明信號(hào)肽具有高度的變異性,這可能與蛋白功能多樣化及生物進(jìn)化相關(guān)。

表2 10種FGF蛋白多肽鏈及信號(hào)肽長(zhǎng)度

斑馬魚(yú)FGF分泌蛋白信號(hào)肽包括N結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域、H結(jié)構(gòu)域3個(gè)功能域。由表3可以看出,斑馬魚(yú)FGF分泌蛋白信號(hào)肽N結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度變化為3至23個(gè)氨基酸,平均為15個(gè)氨基酸;H結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度變化為10至12個(gè)氨基酸,平均為10.6個(gè)氨基酸;這種信號(hào)肽的N結(jié)構(gòu)域和H結(jié)構(gòu)域的變化可能與不同生物物種有關(guān)。在信號(hào)肽中,除了FGF19(NP001012246),FGF4(NP571710)外,其 N區(qū)平均含有1～2個(gè)正電荷的賴(lài)氨酸K或精氨酸R,其中FGF10a(NP878290)含的最多為4個(gè)。C結(jié)構(gòu)域在-3位置上纈氨酸(V)出現(xiàn)的次數(shù)最多為6次,丙氨酸出現(xiàn)3次,半胱氨酸出現(xiàn)最少為1次;-2位置上亮氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸都出現(xiàn)3次,丙氨酸和谷氨酸各出現(xiàn)1次;-1位置上絲氨酸和丙氨酸都出現(xiàn)3次,甘氨酸和半胱氨酸出現(xiàn)2次。

表 3 10種 FGF蛋白的N、H、C結(jié)構(gòu)域

2.3 編碼分泌小蛋白的亞細(xì)胞位置 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要信息,也是蛋白質(zhì)功能研究的重要方面。了解蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息,可以為我們推斷蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能提供必要的幫助。因此,本文采用Subloc v 1.0預(yù)測(cè)了26個(gè)小蛋白的亞細(xì)胞位置。從圖2可看出,這些蛋白的功能場(chǎng)所包括細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外。其中分泌到細(xì)胞核的蛋白數(shù)量是最多的,提示細(xì)胞核可能是這些蛋白的主要功能場(chǎng)所。

3 討論

圖2 斑馬魚(yú)26個(gè)FGF蛋白的亞細(xì)胞定位

本研究通過(guò)應(yīng)用 Signal P3.0、TMHMM v 2.0、Big-PIpredictor、TargetPv1.1四種準(zhǔn)確度比較高的蛋白分析組合軟件對(duì)斑馬魚(yú)26個(gè)FGF分泌蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析和研究,發(fā)現(xiàn)有10個(gè)FGF蛋白具分泌信號(hào)肽。斑馬魚(yú)FGF蛋白信號(hào)肽的氨基酸組成主要以非極性的氨基酸殘基為主,這可能與信號(hào)肽的功能與質(zhì)膜識(shí)別的屬性有關(guān)。但是信號(hào)肽長(zhǎng)度有一定的差異,說(shuō)明信號(hào)肽可能具有高度的變異性。蛋白質(zhì)只有轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的靶部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)[6]。蛋白質(zhì)要轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的部位是由信號(hào)肽決定的,不同的作用位點(diǎn),對(duì)應(yīng)不同的信號(hào)肽。

已有研究表明,多數(shù)分泌蛋白在多肽的N端具有信號(hào)肽用于指導(dǎo)蛋白運(yùn)送到蛋白的正確作用位點(diǎn)。盡管不同的分泌蛋白的信號(hào)肽存在差異,但一般包括3個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域,即N結(jié)構(gòu)域、H結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域[7]。本研究也獲得了相同的信息,具備分泌蛋白特征的斑馬魚(yú)FGF蛋白的信號(hào)肽均具有上述3個(gè)結(jié)構(gòu)域,但是各個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度和氨基酸組成有一定差異。這可能和它們的分泌功能和分泌特性有關(guān)。

通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)FGF氨基酸序列的分析,發(fā)現(xiàn)在構(gòu)成信號(hào)肽的氨基酸具有一定的保守性,如主要以非極性的為主且在酶切位點(diǎn)的氨基酸殘基的組成中幾乎沒(méi)有酸性氨基酸和堿性氨基酸,這可能與信號(hào)肽的與質(zhì)膜識(shí)別的屬性有關(guān)。但是信號(hào)肽本身卻是高度進(jìn)化的,在所分析的具有信號(hào)肽的蛋白中沒(méi)有相同的信號(hào)肽,他們的同源性也很差。這種情況可能與信號(hào)肽功能的精密分工是密切相關(guān)的。因?yàn)榈鞍滓惺蛊湔_的功能,首先必須移位到其正確的亞細(xì)胞作用位點(diǎn)。亞細(xì)胞位點(diǎn)的識(shí)別正是由信號(hào)肽決定的,不同的作用位點(diǎn),就應(yīng)該有不同的信號(hào)肽[7]。但是每一類(lèi)蛋白的信號(hào)肽的保守和進(jìn)化程度如何,還需要更多的信號(hào)肽的信息。

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