梁 堯,張釗偉,張瑞莉,葛 銘

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

水提醇沉法是傳統(tǒng)的中藥澄清分離法,但是水提醇沉法有耗時(shí)、成本高、有污染及存在乙醇?xì)埩舻热秉c(diǎn)。因此又提出了高速離心法、殼聚糖絮凝澄清法等新方法[1-2]。高速離心法和殼聚糖絮凝澄清法具有省時(shí)、成本低、無污染及無藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)。但是這兩種方法對(duì)中藥提取液中有效成分是否有影響,對(duì)中藥提取液在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗病毒效果如何,還未見有報(bào)道。本試驗(yàn)以金銀花提取液為例,通過比較高速離心法、殼聚糖絮凝澄清法與水提醇沉法三種方法處理的金銀花提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒作用研究,探討3種中藥澄清分離方法的優(yōu)劣,為今后進(jìn)行中藥雞胚抗病毒試驗(yàn)以及選擇更合適的中藥提取液的澄清分離方法提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 10日齡雞胚,購(gòu)自哈爾濱遠(yuǎn)大孵化場(chǎng);雞新城疫病毒(M uk teswar I系),由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng),EID50為10-4.5;金銀花,購(gòu)自哈爾濱中藥大市場(chǎng);殼聚糖,購(gòu)自上海展云化工廠。

1.2 雞紅細(xì)胞懸液 參照《動(dòng)物病毒學(xué)》[3]紅細(xì)胞懸液的制備方法,配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 殼聚糖絮凝劑制備 準(zhǔn)確稱取1 g的殼聚糖,用1%冰醋酸溶液溶解,定容至100mL。使配成含殼聚糖1%溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配[4]。

1.4 金銀花提取液制備 準(zhǔn)確稱取150 g的金銀花,浸泡2 h,按常規(guī)方法煎煮,濃縮至150 mL。然后等分為3份,第1份金銀花提取液12 000 r/min離心20 min,取上清液,用生理鹽水定容至50 mL。第2份金銀花提取液中緩慢加入3 mL 1%殼聚糖溶液,邊加邊攪拌,100 r/min攪拌10 min,50℃水浴12 h,3 000 r/min離心10 m in,取上清液用生理鹽水定容至50 mL。第3份金銀花提取液先用無水酒精配成含65%酒精的溶液,4℃冰箱保存過夜,過濾去除沉淀。蒸餾掉酒精,再加無水酒精至含85%酒精的溶液,4℃冰箱保存過夜,過濾去除沉淀,蒸餾去掉酒精,剩余液體用生理鹽水定容至50 mL。把3種方法處理的金銀花提取液用流通蒸汽法滅菌30 m in,4℃密封保存。

1.5 金銀花提取液對(duì)雞胚最大無毒濃度試驗(yàn) 將3種方法處理的金銀花提取液用生理鹽水按照1∶1,1∶2,1∶4,1∶8的濃度做倍比稀釋,將不同稀釋度的金銀花提取液分別接種于10日齡雞胚尿囊腔中,每枚雞胚 0.2 mL,每個(gè)濃度設(shè) 5個(gè)重復(fù),置37℃恒溫箱內(nèi)孵育,棄去24 h內(nèi)死亡胚,活胚繼續(xù)孵化直至出雛。

1.6 不同方法處理的金銀花提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒試驗(yàn) 將3種方法處理的金銀花提取液原液與100 EID50的新城疫病毒液按照不同方式接種于雞胚尿囊腔內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn),具體方法如下：

接種方式1：將金銀花提取液與等量的100 EID50新城疫病毒液混合后接種雞胚尿囊腔內(nèi),每枚0.2 mL,每種方法處理的金銀花提取液設(shè)5個(gè)重復(fù)。石蠟封口,37℃恒溫箱孵化72 h,棄去24 h內(nèi)死亡胚,測(cè)定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

接種方式2：先將100 EID50新城疫病毒液接種雞胚尿囊腔內(nèi),每枚0.2 mL。2 h后再將金銀花提取液接種雞胚尿囊腔內(nèi),每枚0.2 mL,每種方法處理的金銀花提取液設(shè)5個(gè)重復(fù)。石蠟封口,37℃恒溫箱孵化72 h,棄去24 h內(nèi)死亡胚,測(cè)定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

接種方式3：先將金銀花提取液接種雞胚尿囊腔內(nèi),每枚0.2 mL,每種方法處理的金銀花提取液設(shè)5個(gè)重復(fù)。2 h后再給每枚雞胚尿囊腔接種0.2 mL 100 EID50新城疫病毒液。石蠟封口,37℃恒溫箱孵化72 h,棄去24 h內(nèi)死亡胚,測(cè)定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

以上試驗(yàn)同時(shí)設(shè)立病毒及生理鹽水對(duì)照。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分析各組間差異。

2 結(jié)果

2.1 金銀花提取液對(duì)雞胚最大無毒濃度見表1。

經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn),3種方法處理的金銀花提取液原液及稀釋液對(duì)雞胚均無明顯致死作用,雞胚全部存活。

2.2 3種方法處理的金銀花提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒結(jié)果見表2。

表1 金銀花提取液對(duì)雞胚最大無毒濃度試驗(yàn)結(jié)果

表2 金銀花提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見,病毒對(duì)照組的雞胚全部死亡,生理鹽水對(duì)照組和接種金銀花提取液組的雞胚全部存活;新城疫病毒和金銀花提取液在接種方式1中的雞胚血凝效價(jià)與病毒對(duì)照組的雞胚血凝效價(jià)比較,差異極顯著(P＜0.01);在接種方式2中的雞胚血凝效價(jià)與病毒對(duì)照組的雞胚血凝效價(jià)比較,差異顯著(P＜0.05);在接種方式3中的雞胚血凝效價(jià)與病毒對(duì)照組的雞胚血凝效價(jià)比較,差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

3.1 在本試驗(yàn)中,病毒對(duì)照組的雞胚全部死亡,而生理鹽水對(duì)照組和接種金銀花提取液組的雞胚均全部存活,一方面說明金銀花提取液有良好的抗新城疫病毒作用;另一方面說明3種澄清分離方法均能有效的的去除金銀花提取液中的大分子物質(zhì),金銀花提取液澄清度良好,沒有引起雞胚過敏反應(yīng)。

同時(shí)在試驗(yàn)中,新城疫病毒和金銀花提取液接種方式1和方式2中,高速離心法和殼聚糖絮凝澄清法處理的金銀花提取液抗新城疫病毒作用與水提醇沉法處理的金銀花提取液抗新城疫病毒作用相同;在接種方式3中,高速離心法和殼聚糖絮凝澄清法處理的金銀花提取液抗新城疫病毒作用略好于水提醇沉法處理的金銀花提取液?？梢姼咚匐x心法和殼聚糖絮凝澄清法不僅具有省時(shí)、成本低、無污染及無藥物殘留等優(yōu)點(diǎn),而且還能有效的保留金銀花提取液中有效成分,具有和水提醇沉法處理的金銀花提取液同樣的抗新城疫病毒作用。

3.2 本試驗(yàn)只是比較了3種澄清方法處理的100%濃度的金銀花提取液在雞胚中的抗新城疫病毒作用,但是3種方法處理的金銀花提取液在稀釋后是否具有同樣的抗新城疫病毒作用,還有待進(jìn)一步研究。

[1] 殷士海,蘇瑞強(qiáng),朱喃風(fēng),等.中藥澄清分離技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展[J].中國(guó)藥業(yè),1999,8(11)：56-57.

[2] 王海軍,羅維早.吸附澄清劑在中藥提取分離中的應(yīng)用[J].重慶中草藥研究,2006,12(2)：30-33.

[3] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,1997：479-499.

[4] 陳浩,田景振.吸附澄清技術(shù)[J].山東中醫(yī)雜志,2000,19(3)：176-179.