任曉鋒,朱文靜,馬海樂,陳 鈞

1江蘇大學食品與生物工程學院;2江蘇大學京江學院,鎮(zhèn)江 212013

胡蘆巴籽中特征性香味成分分析

任曉鋒1＊,朱文靜2,馬海樂1,陳 鈞1

1江蘇大學食品與生物工程學院;2江蘇大學京江學院,鎮(zhèn)江 212013

為建立胡蘆巴籽中特征性香味成分胡蘆巴內(nèi)酯含量的分析方法,采用溶劑提取及 Oldershow柱濃縮胡蘆巴籽中的胡蘆巴內(nèi)酯,氣相色譜外標法定量分析胡蘆巴內(nèi)酯的含量,氣相色譜-質(zhì)譜法定性鑒定胡蘆巴內(nèi)酯的結(jié)構(gòu);并測定了安徽產(chǎn)的胡蘆巴籽中的胡蘆巴內(nèi)酯的含量;結(jié)果標明采用氣相色譜法分析胡蘆巴內(nèi)酯,高效、準確、重現(xiàn)性好、分析時間適中。

胡蘆巴;胡蘆巴內(nèi)酯;氣相色譜法;氣相色譜-質(zhì)譜法

胡蘆巴 (Trigonella foenum-graecumL.),別名香草、香豆子、苦豆等,為豆科胡蘆巴屬一年生草本植物,全株具香氣。廣泛分布于亞洲、非洲和歐洲。胡蘆巴籽的乙醇浸膏微甜有苦味,具有令人愉快的焦糖樣烤香,常用于煙草加香工藝中,能抑制煙的辛辣刺激性,掩蓋雜氣,矯正吸味,增添煙香[1]。

對于胡蘆巴籽中的特征性風味成分的研究,Girardon,P.等最先報道其特殊風味可能與胡蘆巴內(nèi)酯 3-Hydroxy-4,5-d imethyl-2(5H)-furanone(sotolone)有關(guān)[2],結(jié)構(gòu)式見圖 1。 Imre Blank等的研究也證實了這一結(jié)論,并發(fā)現(xiàn)它的香味閾值非常低,在0.02 ng/L空氣、0.3μg/L水中,人的鼻子即可以感覺到,具有很強的調(diào)香潛力[3]。國內(nèi)相關(guān)研究不多,董麗等用自制的新型固相微萃取(SPME)涂層。對胡蘆巴浸膏的揮發(fā)性成分進行萃取,用氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)進行分離分析,共鑒定出 29種成分[4],但是未鑒定出胡蘆巴內(nèi)酯,這可能在制備胡蘆巴浸膏的過程中,濃縮時引起胡蘆巴內(nèi)酯成分丟失。目前未曾看到國內(nèi)有關(guān)胡蘆巴籽中胡蘆巴內(nèi)酯的提取及分析方法報道。本文首次從安徽產(chǎn)胡蘆巴籽中提取胡蘆巴內(nèi)酯,氣相色譜外標法定量分析了胡蘆巴內(nèi)酯的含量,并應(yīng)用 GC/MS聯(lián)用技術(shù)進行了鑒定,為其含量分析提供依據(jù)。

圖 1 胡蘆巴內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of sotolone

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

胡蘆巴籽:購自鎮(zhèn)江存仁堂藥店,產(chǎn)地安徽,經(jīng)生藥學研究所歐陽臻教授鑒定為豆科胡蘆巴屬植物胡蘆巴的成熟種子;胡蘆巴內(nèi)酯標準品:大連金菊香料有限公司產(chǎn)品,純度大于 97;石油醚 (60～90℃):分析純,使用前經(jīng) Oldershow柱精餾處理;無水乙醇、Na2CO3、Na2SO4、濃 HCl、NaCl等試劑均為分析純。

Agilent 4890D氣相色譜儀:美國安捷倫公司;鐵碾槽;Oldershow精餾柱;6890N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國惠普公司);N2000色譜工作站 (浙江大學智能研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試液制備

胡蘆巴籽(100 g)加入 200 mL水-乙醇 (95∶5, v/v)溶液置于鐵碾槽中研磨,將研磨的混合物置于高速組織搗碎機中,再加入 200 mL水-乙醇 (95∶5, v/v)溶液高速搗碎(2×10 min),離心 30 min(10000 rpm),上清液用 3×400 mL石油醚萃取,有機相加入 3×100 mL飽和Na2CO3萃取酸性飽和部分,分液后水相加入 5 mol/L HCl酸化調(diào) pH=2,再用 4× 100 mL石油醚萃取,有機相再用飽和 NaCl洗滌,然后用Oldershow柱濃縮至 10 mL以下,無水 Na2SO4干燥,定容至 10 mL,即為供試液。

圖 2 Oldershow精餾柱裝置Fig.2 Oldershow fractionation apparatus

Oldershow柱是一個小型精餾裝置,由分餾頭、精餾柱和蒸餾瓶三部分組成,精餾柱的夾套抽真空,柱體內(nèi)部填充玻璃珠,改善氣液接觸。蒸餾瓶中的混合物中的各組分,由于物質(zhì)沸點的不同,先后經(jīng)過精餾柱,通過分餾頭部分的活塞控制回流比,可以使低沸點易揮發(fā)組分從分餾頭分出,高沸點難揮發(fā)組分則回流到蒸餾瓶中,從而達到不同沸點的多種組分分餾提純的目的。

1.2.2 氣相色譜條件

Agilent 4890D氣相色譜儀,HP-1毛細管柱 (30 m×0.250 mm×0.25μm),進樣口溫度 250℃,F ID檢測器溫度為 250℃,起始溫度 90℃,保留 5 min,程序升溫速率 15℃/min,終止溫度 210℃,保留 5 min,載氣高純氮氣,載氣流速約 1 mL/min,總流量為 34 mL/min,分流比約 40:1。進樣 1μL。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

毛細管氣相色譜柱 HP-5MS(0.25 mm×30 m ×0.25μm),載氣氦氣,流速 50 mL/min,分流比 50∶1,進樣口溫度 240℃,柱溫:初溫 90℃、保留 5 min,終溫 210℃、保留 10 min,升溫速率 15℃/min。電子轟擊源 EI,電離能量70 ev,離子源溫度 260℃。質(zhì)量掃描范圍為 30～380 amu,進樣量 1μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 胡蘆巴內(nèi)酯的氣相色譜定性分析

圖 3為胡蘆巴內(nèi)酯標準品的氣相色譜圖,圖 4為“1.2.2氣相色譜條件”項下樣品的色譜圖。由圖4可以看出樣品處理以后排除了脂肪酸的干擾,并且使胡蘆巴內(nèi)酯得到了富集。氣相色譜的分離效果良好,保留時間適宜,且樣品和標準品的出峰時間一致,可以推斷為同一種物質(zhì)。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定胡蘆巴內(nèi)酯

圖 5為胡蘆巴內(nèi)酯樣品的總離子流質(zhì)譜圖,圖6為胡蘆巴內(nèi)酯樣品的質(zhì)譜圖。胡蘆巴內(nèi)酯的定性是經(jīng)測定其質(zhì)譜、查閱有關(guān)文獻[5],并結(jié)合有機化合物的質(zhì)譜斷裂規(guī)律來確定的。圖 6中的分子離子峰為m/z128。圖 7為胡蘆巴內(nèi)酯質(zhì)譜峰可能的形成過程。

2.3 胡蘆巴內(nèi)酯標準曲線的建立

精密稱取胡蘆巴內(nèi)酯標準品適量,加入精餾處理的石油醚,超聲促溶,配制 81μg/mL,101μg/ mL,162μg/mL,202μg/mL和 1013μg/mL的胡蘆巴內(nèi)酯標準溶液,按照“1.2.2氣相色譜條件”分析,每個樣品進樣 3次,取峰面積的平均值。以濃度為橫坐標,胡蘆巴內(nèi)酯峰面積為縱坐標做線性回歸,得回歸方程 Y=796.48+63036X,線性范圍 81～1013μg/mL。R2=0.9993。

圖 7 胡蘆巴內(nèi)酯樣品的質(zhì)譜分析Fig.7 Mass spectrum analyses of sotolone from fenugreek

2.4 精密度和重現(xiàn)性試驗

以同一份胡蘆巴內(nèi)酯標準品溶液,連續(xù)進樣 5次,每次1μL,記錄色譜圖,以色譜峰面積計算,RSD =2.18%(n=5),按胡蘆巴樣品液制備方法提取,按胡蘆巴內(nèi)酯樣品液制備方法提取制備 5份平行的樣品供試液,進行進樣,每份供試液進樣 1μL,連續(xù)進樣 5次,RSD=3.02%(n=5)。

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的胡蘆巴籽,添加 1 mL的 0.1 mg/ mL標準品的石油醚溶液于原料中,按照樣品供試液制備方法提取、測定,并計算回收率。平均回收率為96.14%,RSD=2.26%(n=5).

表 1 胡蘆巴內(nèi)酯的加樣回收率實驗Table 1 Results of sotolone’s recovery test

2.6 穩(wěn)定性試驗

將樣品供試液在室溫下貯存,于 0、0.5、2、4、8、12、24 h測定,結(jié)果樣品溶液在 24 h內(nèi)基本穩(wěn)定, RSD=3.24%(n=7)。由于分析樣品以石油醚為溶劑,而石油醚易揮發(fā),因此樣品宜現(xiàn)配現(xiàn)測,避免由于溶劑揮發(fā)造成的誤差。

2.7 樣品測定結(jié)果

對安徽產(chǎn)的胡蘆巴籽中的胡蘆巴內(nèi)酯的含量進行了測定,每個樣品重復試驗三次,取其平均值,含量為 4.5 mg/kg。

2.8 討論

本實驗中測得安徽產(chǎn)的胡蘆巴籽中的胡蘆巴內(nèi)酯含量很低,只有 4.5 mg/kg,但也在文獻[3]報道的不同產(chǎn)地、不同年份的胡蘆巴籽中的胡蘆巴內(nèi)酯含量(3 mg/kg～25 mg/kg)范圍內(nèi),并且貯存時間越長,含量增高。這可能是因為產(chǎn)地的不同影響了胡蘆巴籽中胡蘆巴內(nèi)酯前體物的含量,而貯存時間的長短影響了胡蘆巴內(nèi)酯前體物轉(zhuǎn)化為胡蘆巴內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化過程。但是即使是貯存了 10年的胡蘆巴籽,其胡蘆巴內(nèi)酯含量也只有 25.1 mg/kg。陳永寬等[6]等設(shè)計了一種合成胡蘆巴內(nèi)酯的簡便方法:以草酸二乙酯為原料,經(jīng)二步反應(yīng)合成胡蘆巴內(nèi)酯。操作簡便,產(chǎn)率為 67%,合成路線如下:

圖 8 胡蘆巴內(nèi)酯的合成路線[9]Fig.8 The synthesis process of sotolone[9]

食品行業(yè)使用胡蘆巴浸膏作為食用香料,由文獻[4]的結(jié)果可以看出在制備胡蘆巴浸膏的過程中胡蘆巴內(nèi)酯成分已經(jīng)丟失了,因此使用時可以將胡蘆巴內(nèi)酯合成品添加到胡蘆巴浸膏中,以期得到更佳的增香效果。

3 結(jié)論

本文建立了胡蘆巴內(nèi)酯的氣相色譜分析方法,高效、準確、分析時間適中,可用于原料中胡蘆巴內(nèi)酯的定性及定量分析。

1 Mao DB(毛多斌).Cigarette Blend and Flavoring(卷煙配方和香精香料).Beijing:Chemical Industry Press,001.200-203.

2 Sauvaire Y,Girardon P,Baccou JC,et al.Changes in growth, proteins and free amino acids of developing seed and pod of fenugreek.Phytochem istry,1984,23:479-486.

3 Blank I,Lin JM,Devaud S,et al.The Principal Flavor Components of Fenugreek(Trigonella foenum-graecum L.).ACS Sym posium Series,1997,660(3):12-28.

4 DongL(董麗),CaiLS(蔡凌霜),Zhu SK(朱書奎).Analysis of Volatile Components of Fenugreek Concrete by Gas Chromatography/Mass Spectrometry with Solid-Phase Microextraction.J W uhan Univ,Nat Sci(武漢大學學報,理學版),2004,(2):151-156.

5 Zhang ZX(張正行).Spectrum Analysis of Organic Compounds(有機光譜分析)Beijing:People’sMedical Publishing House,2009.188-208.

6 Chen YK(陳永寬),Kong NC(孔寧成),Li C(李聰),et al.A Convenient Synthesis of Fenugreck Lactone.Fine Chem (精細化工),2002,9:510-511.

Analysis of the Principal Flavor Components in Fenugreek(Trigonella foenum-graecumL.)

REN Xiao-feng1＊,ZHU Wen-jing2,MA Hai-le1,CHEN Jun11School of Food and B iological Engineering;2Jing jiang college,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China

In order to establish a method for deter mination of the principal flavor components sotolone in fenugreek,sotolone was extracted from fenugreek by solvent and concentrated on Oldershow column.Sotolone in fenugreek was determinated according to the extra-calibration curve by GC and identificated by GC-MS.Sotolone in fenugreek produced in Anhui province was determinated.The method using GC-MS and GC was high-efficient,precise,and stable with an acceptable analysis time.

fenugreek;sotolone;GC;GC-MS

1001-6880(2010)06-1065-04

2009-05-31 接受日期:2009-09-24

中國煙草總公司云南省公司項目(2001(B)203)

＊通訊作者 Tel:86-511-88780201;E-mail:rxfzwj@126.com

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