戶業(yè)麗 ，蔡煥煥 ，程波 ，呂中 ，曾琨琨 ，藍澤橋

（1.武漢工程大學(xué)綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073；2.湖北天峽鱘業(yè)有限公司，湖北 宜都 443300）

人工養(yǎng)殖鱘魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝

戶業(yè)麗1，蔡煥煥1，程波1，呂中1，曾琨琨1，藍澤橋2

（1.武漢工程大學(xué)綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073；2.湖北天峽鱘業(yè)有限公司，湖北 宜都 443300）

對人工養(yǎng)殖鱘魚頭中硫酸軟骨素采用稀堿法進行提取工藝的研究，以硫酸軟骨素產(chǎn)率為考察對象，對影響產(chǎn)率的因素進行了單因素試驗，并在此基礎(chǔ)上通過正交試驗，確定硫酸軟骨素提取的最佳工藝。試驗結(jié)果表明：提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件為NaOH濃度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提溫度：25℃、浸提時間：20 h。在此條件下硫酸軟骨素的提取率為48.9%，其蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為0.980%和0.130%。

硫酸軟骨素；鱘魚頭；提取工藝；正交試驗

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，簡稱 Chs）在體內(nèi)以蛋白聚糖聚集體的形式存在于軟骨、腱、韌帶和主動脈等組織中，是糖胺聚糖的一種[1]。作為一種天然的生物高分子化合物，硫酸軟骨素具有促進冠狀動脈循環(huán)、降血脂、抗病毒、抗凝血、抗腫瘤等生物活性[2-5]。此外，硫酸軟骨素在醫(yī)藥、保健食品、美容化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛[6-8]。

硫酸軟骨素廣泛分布于人和一些動物如豬、牛、羊和魚等組織中，是動物的軟骨、血管壁、皮膚等結(jié)締組織的重要組成成分之一[1]。

鱘魚是一種軟骨硬鱗魚[9]，除軟骨本身之外，鱘魚魚頭中富含軟骨。對人工養(yǎng)殖鱘魚的加工來說，鱘魚魚頭是一種下腳料，而從人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中提取硫酸軟骨素鮮見文獻報道，基于此，本文對人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝進行研究，以期為鱘魚資源的開發(fā)和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭：由天峽鱘業(yè)有限公司提供。

1.1.2 試劑

鹽酸（AR）：信陽淮河化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；氫氧化鈉（AR）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（進口分裝），考馬斯亮藍（進口分裝）。

1.1.3 儀器

LD4-2A型低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；eppendorf centrifuge 5417R型冷凍微量離心機；FD-1冷凍干燥機：北京博醫(yī)康技術(shù)公司；TU-1800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BRUKER EQUINAX55傅里葉紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭制備軟骨粉

取出冷凍的鱘魚魚頭，流水化凍后，取出軟骨，于70℃水浴中加熱，除去脂肪及肉，再切成小塊，50℃烘箱中干燥，粉碎得軟骨粉，備用。

1.2.2 人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的提取

于磁力攪拌提取瓶中，加入一定量軟骨粉，氫氧化鈉溶液，在一定的溫度下攪拌浸提，浸提完畢后以鹽酸調(diào)pH6～7，離心，取上清。在上清液中加入2.5倍95%乙醇，于4℃放置過夜，離心，棄上清，沉淀加適量95%乙醇清洗，離心，收集沉淀，冷凍干燥，得白至淺黃色疏松狀的固體，即硫酸軟骨素。

1.2.3 人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的定性分析

1.2.3.1 硫酸軟骨素中脂肪含量的測定

依據(jù)GB5009.6—85[10]，索氏抽提法測硫酸軟骨素中脂肪的含量。

1.2.3.2 硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法[11]對硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)的含量進行測定。

蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍形成的復(fù)合物在595nm處有最大的光吸收，吸收強度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。將牛血清白蛋白配制成濃度（C，mg/L）分別為20、40、60、80、100 mg/L，與考馬斯亮藍溶液反應(yīng)后，分別測其595 nm處的吸光度（A595）。然后，做C-A595圖，得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線，見圖1，其線性回歸方程為y=0.0031-0.012x（R2=0.9917）。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算在不同條件下提取的硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)的含量ε，見公式①

式中：ω為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)的含量，（mg/L）；w為硫酸軟骨素的質(zhì)量，g。

1.2.3.3 硫酸軟骨素的光譜分析

采用KBr壓片法對硫酸軟骨素進行紅外光譜測定，采用掃描法對硫酸軟骨素進行紫外光譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaOH濃度對人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變NaOH濃度,考察NaOH濃度變化對硫酸軟骨素提取率的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在NaOH濃度低時，隨NaOH濃度的增加，硫酸軟骨素的提取率也隨之增加；但NaOH濃度超過一定值后，再增加NaOH濃度，硫酸軟骨素的提取率迅速降低。硫酸軟骨素在蛋白聚糖聚集體中與蛋白之間以糖苷鍵相連，提取硫酸軟骨素時，必須破壞多糖鏈與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合才能達到提取硫酸軟骨素的目的，NaOH所起的作用就是一方面破壞糖苷鍵，另一方面降解蛋白質(zhì)分子中的肽鍵，因此隨其濃度增加，糖苷鍵和肽鍵不斷地斷裂，釋放出硫酸軟骨素，即硫酸軟骨素的提取率增加；但濃度超過一定值后，再增加NaOH濃度，反應(yīng)體系堿性增強，硫酸軟骨素分子中的糖苷鍵也會降解，造成硫酸軟骨素?fù)p失而使提取率降低，所以NaOH濃度應(yīng)控制在0.06 kg/L左右。

2.2 軟骨粉質(zhì)量/NaOH溶液體積比對人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變軟骨粉質(zhì)量/NaOH溶液體積比（固液比）,考察固/液比變化對硫酸軟骨素提取率的影響,結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，液/料比的增加，硫酸軟骨素的提取率也隨之增加，但固液比超過1/5（g/mL），提取率增加有限，而反應(yīng)體系的容積加大，在醇沉工序中，大量消耗乙醇，所以，從經(jīng)濟和清潔生產(chǎn)角度來說，固液/料比保持在1/5（g/mL）比較合適。

2.3 浸提溫度對硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變浸提溫度,考察浸提溫度對硫酸軟骨素提取率的影響,結(jié)果見圖4。

由圖4所示，浸提溫度增加，在一定溫度范圍內(nèi)可提高硫酸軟骨素的提取率，但溫度超過25℃后，隨溫度升高，硫酸軟骨素分子中的糖苷鍵會降解，不僅造成提取率降低，還會使產(chǎn)品顏色變黃，所以浸提溫度為25℃左右。

2.4 浸提時間對人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響

按1.2.2操作,其它條件不變,改變浸提時間,考察浸提時間對硫酸軟骨素提取率的影響,結(jié)果見圖5。

由圖5可知，適當(dāng)?shù)匮娱L浸提時間，可提高硫酸軟骨素的提取率，但浸提時間超過20 h后，再延長時間，硫酸軟骨素提取率增加不多，反而會使產(chǎn)品外觀變差，故浸提時間以20 h為宜。

2.5 正交試驗確定人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取的最佳工藝條件

為確定最佳提取工藝，采用L9（34）正交試驗，以NaOH濃度、固/液比、浸提溫度、浸提時間為試驗因子（見表1），硫酸軟骨素的提取率為指標(biāo)進行正交試驗，結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table1 The level of factors table

表2 正交試驗的結(jié)果分析Table2 Resultanlysisoforthogonalexperiment

從表2可知：1）極差越大說明該因子的水平波動時，該因子對試驗的結(jié)果影響就越大，因而按照極差的大小來決定因子的影響順序為：NaOH濃度>浸提溫度>浸提時間>固液比。2）最佳提取工藝的確定。k1，k2，k3反映了因子各水平對試驗的影響，最大的k值對應(yīng)著最好的水平。因此，鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取的最佳工藝條件為：NaOH 濃度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提溫度：25℃、浸提時間：20 h。在此條件下，硫酸軟骨素的提取率為：48.9%（相當(dāng)鱘魚頭軟骨粉質(zhì)量）。

2.6 人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的質(zhì)量分析

2.6.1 硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)的含量

稱取硫酸軟骨素0.100 g,定容至25 mL水中，按1.2.3.2操作（每組取3個樣，每個樣品測3次），取平均，代入公式①，計算得硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)的含量為0.980%。

2.6.2 硫酸軟骨素中脂肪的含量

按1.2.3.1操作，采用索氏抽提法測硫酸軟骨素中粗脂肪的含量為0.130%。

2.6.3 硫酸軟骨素光譜分析

采用KBr壓片法，對硫酸軟骨素在400 cm-1～4000 cm-1進行掃描，得到硫酸軟骨素的紅外吸收光譜，見圖6。

在200 nm～400 nm進行掃描，得到硫酸軟骨素的紫外吸收光譜，見圖7。

由圖6可知：在3470 cm-1附近有一寬的強吸收峰，為糖環(huán)上羥基的伸縮振動所引起的，在2926 cm-1附近有糖分子中C-H伸縮振動的特征峰，在1658 cm-1附近有乙酰氨基的N-H伸縮振動，在1131 cm-1和1072cm-1附近有C-O伸縮振動，在1259cm-1和827cm-1附近有硫酸基團的振動，說明樣品中含有硫酸軟骨素所有乙酰氨基、羧基、硫酸基、和糖環(huán)等官能團。

由圖7可知：樣品在268 nm～280 nm之間無核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰，而在220 nm附近有糖的吸收，且峰型尖銳，說明硫酸軟骨素樣品中核酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量少。

3 結(jié)論

1）首次對人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭中硫酸軟骨素的提取工藝進行了研究，用稀堿法提取得到了硫酸軟骨素,為人工養(yǎng)殖鱘魚資源的綜合利用提供了依據(jù)。

2）在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計了正交試驗，正交試驗表明：各因子對鱘魚頭中硫酸軟骨素提取率的影響大小為：NaOH濃度>浸提溫度>浸提時間>料液比；鱘魚魚頭中硫酸軟骨素提取的最佳工藝條件為：NaOH濃度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提溫度：25 ℃、浸提時間：20 h。在此條件下，硫酸軟骨素的提取率為：48.9%（相當(dāng)鱘魚頭軟骨粉質(zhì)量）。

3）對提取的硫酸軟骨素進行了蛋白質(zhì)含量和的脂肪含量分析，結(jié)果表明硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)和脂肪的含量分別為0.980%和0.130%。

4）硫酸軟骨素的光譜分析表明，提取的硫酸軟骨素樣品中核酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量少。

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Study on Extraction Technology of Chondroitin Sulfate from the Head of Farmed Sturgeon

HU Ye-Li1,CAI Huan-Huan1,CHENG Bo1,LüZhong1,ZENG Kun-kun1,LAN Ze-qiao2
（1.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education＆Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，Hubei,China;2.HuBei Tianxia Sturgeon Company，Yidu 443300，Hubei，China）

Extraction technology of chondroitin sulfate from the head of farmed sturgeon was studied by dilute alkali,extraction rate of chondroitin sulfate was as a study object,single factor experiment and orthogonal experiment was carried out.The results show that the optimal condition of extraction was 0.06 kg/L of concentration of NaOH,the ratio of cartilage powder and the volume of sodium hydroxide is 1/5（g/mL）,25℃of temperature,and 20 h of extraction time.The extraction rate of chondroitin sulfate was 48.9%under the said condition.The content of protein and fat of chondroitin sulfate was 0.980%and 0.130%respectively.

chondroitin sulfate；the head of sturgeon；extraction technology；orthogonal experiment

09年湖北省基礎(chǔ)化學(xué)示范中心資助

戶業(yè)麗（1963—），女（漢），副教授，碩士，主要從事生物活性物質(zhì)的分離、純化及活性研究工作。

2009-07-05