劉俊奇, 劉青坡, 曹慶珍, 錢麗娟, 郭素珍, 施華宏

(華東師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)系上海市城市化過程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200062)

全氟辛磺酸對于爪蟾的甲狀腺激素干擾效應(yīng)

劉俊奇, 劉青坡, 曹慶珍, 錢麗娟, 郭素珍, 施華宏

(華東師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)系上海市城市化過程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200062)

運(yùn)用兩棲類變態(tài)實(shí)驗(yàn)(AMA)研究了全氟辛磺酸(PFOS)對于非洲爪蟾(Xenopuslaevis)蝌蚪的生長、變態(tài)和甲狀腺組織結(jié)構(gòu)的影響.結(jié)果顯示,與對照組相比,7d后,10,50和250μg·L-1PFOS暴露組蝌蚪的后肢長分別減小了17%,11%和18%,蝌蚪的發(fā)育延緩了1～2個階段;19d后,10,50和250μg·L-1PFOS組蝌蚪的體重分別增加了17%,10%和20%,體長分別增加了5%,4%和6%,而10μg·L-1和250μg·L-1PFOS組蝌蚪的后肢長分別減小了12%和13%;暴露組甲狀腺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)濾泡數(shù)目減少、上皮細(xì)胞增生、膠質(zhì)減少甚至濾泡溶通等現(xiàn)象.結(jié)論是,在本實(shí)驗(yàn)濃度下,PFOS對于非洲爪蟾的蝌蚪生長有促進(jìn)作用,對于變態(tài)發(fā)育過程卻有抑制作用.參照AMA的方法,可以判斷PFOS為抗甲狀腺激素干擾物.

甲狀腺激素干擾物(TDCs); 非洲爪蟾(Xenopus laevis); 全氟辛磺酸(PFOS); 兩棲類變態(tài)實(shí)驗(yàn)(AMA)

0 引 言

全氟辛磺酸(PFOS)作為一種新型持久性環(huán)境污染物已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注.由于應(yīng)用廣泛,它已在全球范圍內(nèi)的環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)存在.我國境內(nèi)水環(huán)境普遍存在PFOS污染[1].2004年,珠江中該物質(zhì)的最高濃度可達(dá)99ng·L-1[2].2006年大連地區(qū)雨雪沉降物中PFOS的含量(幾何均值)高達(dá)145ng·L-1[3].

PFOS可能是一種新的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[4].有研究表明,口服PFOS能夠?qū)е鲁赡甏笫蠹谞钕偎厮降母淖?影響甲狀腺激素相關(guān)基因的表達(dá)[5,6].然而,在另一研究中,用PFOS對妊娠期和哺乳期的大鼠進(jìn)行暴露,則沒有對其甲狀腺形態(tài),激素水平和肝臟相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生明顯影響[7].Ankley等[8]的研究表明,3mg·L-1PFOS能導(dǎo)致北方豹蛙(Rana pipiens)變態(tài)時間推遲,生長減慢,而0.3～1mg·L-1PFOS對北方豹蛙蝌蚪變態(tài)沒有影響.劉青坡等[9]用0.01～1mg·L-1PFOS對非洲爪蟾進(jìn)行6個月的暴露,結(jié)果在2個月時觀察到PFOS暴露對蝌蚪發(fā)育的抑制作用,而在4和6個月時0.01mg·L-1PFOS則表現(xiàn)出對發(fā)育的促進(jìn)作用.可見,目前對PFOS是否具有甲狀腺激素干擾效應(yīng)仍存在意見分歧.因此,有必要采用更靈敏的方法對PFOS是否具有甲狀腺激素干擾效應(yīng)進(jìn)行檢測,并對其作用模式進(jìn)行深入研究.

經(jīng)過多輪論證之后,OECD于2008年發(fā)布了運(yùn)用兩棲類變態(tài)實(shí)驗(yàn)(AMA)篩選甲狀腺激素干擾物的實(shí)驗(yàn)指南.AMA以非洲爪蟾蝌蚪(NF51階段)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?暴露21d.運(yùn)用AMA不僅能有效判斷污染物是否具有甲狀腺激素干擾效應(yīng),同時由于其評價終點(diǎn)是基于化合物作用模式而確定的,對污染物可能的作用模式也具有一定的分析功能.因此,AMA被認(rèn)為是篩選甲狀腺激素干擾物最全面和最有效的方法[10].本文將采用AMA的實(shí)驗(yàn)方案,對PFOS的甲狀腺激素干擾效應(yīng)進(jìn)行檢測,為PFOS的生態(tài)風(fēng)險評價提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 胚胎的獲取和蝌蚪的飼養(yǎng)

成年非洲爪蟾購自美國Nasco公司,采用人工注射絨毛膜促性腺激素(hCG)來誘導(dǎo)爪蟾交配產(chǎn)卵,蝌蚪飼養(yǎng)條件如下:室溫25℃,明暗周期12h/12h;自來水經(jīng)活性炭和微孔過濾系統(tǒng)處理后進(jìn)入養(yǎng)殖箱循環(huán),硬度150～250mg·L-1(CaCO3),余氯低于3μg·L-1,pH 7.0～8.0,溶解氧濃度高于5mg·L-1.

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)

挑選發(fā)育良好的NF51階段蝌蚪用于實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析均參照OECD兩棲類變態(tài)實(shí)驗(yàn)方案[10].實(shí)驗(yàn)共設(shè)1個對照組和3個暴露組,每組設(shè)置4個平行.在5L的方形水培花卉缸內(nèi)(20cm×20cm×18cm)加經(jīng)上述方法處理過的自來水4L,每缸隨機(jī)放20只NF51階段的蝌蚪.PFOS濃度為10,50和250μg·L-1,AMA推薦優(yōu)先采用流水實(shí)驗(yàn)方案,也可以采用靜態(tài)換水實(shí)驗(yàn),根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室條件,本文采用半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方案.實(shí)驗(yàn)期間不曝氣,溫度和光照與飼養(yǎng)條件相同,每天早、中和晚各喂極品七彩神仙魚飼料(惠弘水族開發(fā)有限公司)一次,下午半換水,隨蝌蚪的長大,換不同粒徑的上述飼料同時逐步加大喂食量,觀察蝌蚪的生長發(fā)育狀況并將死亡個體及時清除.

1.3 評價指標(biāo)的檢測

暴露7d后,從各平行樣中隨機(jī)挑選5只蝌蚪,參照NF劃分方式判斷蝌蚪發(fā)育階段[11],隨后用2%的MS-222麻醉后,經(jīng)蒸餾水沖洗后稱體重(BW),讓蝌蚪自然伸展,并用數(shù)碼相機(jī)拍照,根據(jù)照片在Photoshop軟件中測量蝌蚪的體長(SVL,即嘴到泄殖腔的長度)與后肢長(HLL).當(dāng)對照組蝌蚪大部分達(dá)到NF58階段時,將剩余的全部蝌蚪根據(jù)以上的測量方法進(jìn)行第二次觀測.除此之外,根據(jù)已判斷的階段,統(tǒng)計(jì)出對照組中蝌蚪階段的中位數(shù).每個平行樣挑選5只該階段蝌蚪,取其甲狀腺組織按常規(guī)方法制作甲狀腺組織切片.該發(fā)育階段蝌蚪少于5只的,隨機(jī)挑選該階段上下的蝌蚪直至達(dá)到5只.

在Nikon80i光學(xué)顯微鏡下觀察甲狀腺組織結(jié)構(gòu),包括甲狀腺濾泡變形、膠質(zhì)減少、空泡化、增生和肥大等現(xiàn)象.用NikonDS-SM顯微照相系統(tǒng)拍照,并就甲狀腺濾泡數(shù)目(NOF)和濾泡變形率(IFH)做半定量分析[12].從每個樣品的連續(xù)切片中,選取甲狀腺橫截面積最大的10片,統(tǒng)計(jì)每片上的甲狀腺濾泡個數(shù),以10片的平均數(shù)作為該樣品的甲狀腺濾泡數(shù)目.濾泡上皮細(xì)胞的排列形狀出現(xiàn)非自然地明顯彎曲時,記為濾泡變形.在計(jì)數(shù)甲狀腺濾泡數(shù)目的同時計(jì)數(shù)變形的濾泡數(shù)目,濾泡變形率=變形的濾泡數(shù)目/甲狀腺濾泡數(shù)目.

1.4 圖像和數(shù)據(jù)的處理

圖像用Photoshop7.0處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.對于連續(xù)分布的指標(biāo)(BW,SVL和 HLL),結(jié)果以每缸為1個平行樣,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)表示,用Dunnett’stest檢驗(yàn)組間數(shù)據(jù)差異性;對于非連續(xù)指標(biāo)(發(fā)育階段),用各平行樣的中位數(shù)表示,用Jonckheere-Terpstra檢驗(yàn)組間數(shù)據(jù)差異性;用OriginPro8.0作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 PFOS對非洲爪蟾存活和生長的影響

暴露期間,對照組和10μg·L-1PFOS暴露組蝌蚪均沒有出現(xiàn)死亡,50μg·L-1和250μg·L-1PFOS暴露組均有3只蝌蚪死亡,存活率達(dá)96.25%.與對照組相比,7d后,暴露組蝌蚪體重和體長均無顯著性變化;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,10,50和250μg·L-13個PFOS暴露組蝌蚪的體重分別增加17%,10%和20%,體長分別增加5%,4%和6%(見圖1A和B).

對照組與暴露組存活率均在95℅以上,按照OECD爪蟾變態(tài)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于效應(yīng)分析.同時表明,在實(shí)驗(yàn)濃度下PFOS對非洲爪蟾蝌蚪無明顯的致死效應(yīng).從體重和體長的結(jié)果來看,7d后,PFOS對蝌蚪體長和體重沒有影響,在暴露結(jié)束時能夠加快蝌蚪的生長.

2.2 PFOS對非洲爪蟾后肢長和發(fā)育階段的影響

與對照組相比,7d后,10,50和250μg·L-1三個暴露組蝌蚪的后肢長分別減小17%,11%和18%,蝌蚪的發(fā)育延緩了1～2個階段;19d后,對照組大部分蝌蚪達(dá)到NF58階段,參照AMA實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)束實(shí)驗(yàn),與AMA實(shí)驗(yàn)相比,本文對照組蝌蚪提前了2d達(dá)到NF58階段,最主要的原因可能是由于本文采用的是半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法,而AMA的21d是根據(jù)流水實(shí)驗(yàn)獲得的,此外,本實(shí)驗(yàn)的水溫較OECD的方法高2 ℃.10μg·L-1和250μg·L-1暴露組蝌蚪的后肢長分別減小12%和13%,而50μg·L-1暴露組則沒有影響(見圖1C),暴露組蝌蚪的發(fā)育階段與對照組沒有顯著差異(見表1).

圖1 PFOS對非洲爪蟾(Xenopus laevis)體重(BW)、體長(SVL)和后肢長(HLL)的影響(n=4)Fig.Effect s of PFOS on the body weight (BW) , the snout to vent length(SVL) and the hind limb length ( HLL) of Xenop us laevis ( n = 4)

表1 PFOS對非洲爪蟾(Xenopus laevis)發(fā)育階段的影響(n=4)Tab.Effect of PFOS on the developmental stage of Xenopus laevis ( n = 4)

2.3 PFOS對非洲爪蟾甲狀腺組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組爪蟾蝌蚪的甲狀腺濾泡大多呈圓形或橢圓形,濾泡周圍均勻分布單層的上皮細(xì)胞,細(xì)胞呈扁平狀,濾泡腔內(nèi)充滿均勻的膠質(zhì),較少觀察到濾泡的變形和膠質(zhì)減少等現(xiàn)象(見圖2A).19d后,暴露組蝌蚪甲狀腺濾泡出現(xiàn)輕微和中等程度的變形、上皮細(xì)胞增生等現(xiàn)象(見圖2B);在50μg·L-1暴露組甲狀腺組織結(jié)構(gòu)的連續(xù)切片中發(fā)現(xiàn)部分切片的兩個濾泡界線分明,而在其它切片中這兩個濾泡間的上皮細(xì)胞開始溶解,甚至消失,直至兩個濾泡溶通成一個濾泡(見圖2C);同時,部分濾泡出現(xiàn)膠質(zhì)減少甚至全部消失(見圖2D).與對照組相比,10μg·L-1和250μg·L-1暴露組濾泡數(shù)目顯著較少(見圖3A),3個暴露組濾泡變形率均顯著增加(見圖3B).

圖2 PFOS對非洲爪蟾(Xenopuslaevis)甲狀腺組織結(jié)構(gòu)(H.E.染色)的影響Fig.2 Effect s of PFOS on the thyroid histology ( H. E. ) of Xenop us laevis

2.4 PFOS對非洲爪蟾的甲狀腺激素干擾效應(yīng)及其作用模式分析

參照OECD的AMA實(shí)驗(yàn)指南,判斷受試物是否具有甲狀腺激素干擾效應(yīng)主要取決于7d和21d時后肢長(HLL)、發(fā)育階段(NF)和甲狀腺組織結(jié)構(gòu)這3項(xiàng)指標(biāo).在發(fā)育階段被延遲的情況下,需要綜合考慮存活、生長、發(fā)育和甲狀腺組織結(jié)構(gòu)等多項(xiàng)指標(biāo)[10].本文參照AMA的方法,根據(jù)所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對PFOS是否具有甲狀腺激素干擾效應(yīng)及其作用模式進(jìn)行了分析(見圖4).首先,本文暴露組和對照組的死亡率均低于10%,且未觀察到PFOS的明顯急性毒性效應(yīng),表明實(shí)驗(yàn)是有效的;然后,結(jié)合后肢長和發(fā)育階段的指標(biāo),可以判斷PFOS能導(dǎo)致蝌蚪發(fā)育延緩;同時觀察到在本實(shí)驗(yàn)濃度下PFOS對生長具有明顯的促進(jìn)作用,由于影響正常發(fā)育的化合物通常會導(dǎo)致生長的明顯加速,根據(jù)AMA的方法,PFOS對生長的促進(jìn)作用可能是甲狀腺激素干擾效應(yīng)的表現(xiàn),而甲狀腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)的變化則為這一推斷提供了更有力的證據(jù).由于PFOS阻礙了蝌蚪的發(fā)育,可判斷PFOS為抗甲狀腺激素干擾物.

圖3 PFOS對非洲爪蟾 (Xenopuslaevis)甲狀腺濾泡數(shù)目(NOF)和濾泡變形率(IFM)的影響Fig.3 Effect s of PFOS on the number of follicles (NOF) and the incidence of follicle malformation ( IFM) in Xenopus laevis

圖4 運(yùn)用兩棲類變態(tài)實(shí)驗(yàn)(AMA)對PFOS甲狀腺激素干擾效應(yīng)的檢測及其作用模式的分析Fig.4 Detection of thyroid hormone disrupting effect s and analysis of mode of action of PFOS using the amphibian metamorphosis assay (AMA)

從上述分析可知,AMA采用了多項(xiàng)指標(biāo),通過多個分析步驟對受測試物進(jìn)行分析判斷.相對于其他的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[8,9],最明顯的優(yōu)勢表現(xiàn)在:(1)實(shí)驗(yàn)有效性的控制;(2)多項(xiàng)指標(biāo)的綜合判斷;(3)作用模式的解析.在本文的檢測中,不僅通過合理的濃度設(shè)計(jì)和良好的實(shí)驗(yàn)控制確保了實(shí)驗(yàn)的有效性,而且發(fā)育的延緩進(jìn)一步通過生長指標(biāo)的變化得到了印證,二者高度一致地表征了PFOS的抗甲狀腺激素特性.因此,本文通過AMA實(shí)驗(yàn)方法,對判斷PFOS的甲狀腺激素干擾效應(yīng)和分析其作用模式提供了強(qiáng)有力的證據(jù).

3 結(jié) 論

本文參照OECD提出的兩棲類變態(tài)實(shí)驗(yàn)(AMA)方法,對 PFOS的甲狀腺激素干擾效應(yīng)進(jìn)行了檢測.結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)濃度下PFOS對于非洲爪蟾的蝌蚪生長有促進(jìn)作用,對于變態(tài)發(fā)育過程卻有抑制作用.參照AMA的方法,可以初步判斷PFOS為抗甲狀腺激素干擾物.鑒于PFOS在我國水環(huán)境中的普遍存在,同時甲狀腺激素在動物生長和發(fā)育過程中的重要作用,今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)環(huán)境濃度PFOS對水生動物的甲狀腺激素干擾效應(yīng)評估.而且,AMA作為篩選甲狀腺激素干擾物的有效方法,可以考慮在我國推廣和使用.

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Thyroid disrupting effects of perfluorooctane sulfonateon Xenopus l aevis

LIU Jun-qi, LIU Qing-po, CAO Qing-zhen,QIAN Li-juan, GUO Su-zhen, SHI Hua-hong

(Department of Envi ronment Science , S hanghai Key L aboratory of Urbani z ation Processes and EcologicalRestoration , East China N ormal Universit y , S hanghai 200062 , China)

The amphibian metamorphosis assay (AMA) was used to detect thyroid disruptingeffect s of perfluorooctane sulfonate ( PFOS) . Xenopus laevis tadpoles at stage 51 were exposed to 10 , 50 and 250μg·L-1PFOS.PFOS. The growth , metamorphosis and thyroid histology were observed.Af ter 7 days of exposure , the hind limb lengths were decreased by 11 %～18 % , and 1 or 2 developmental stages were delayed in t reatment groups compared with the cont rol. After 19 days of exposure , the body weight s were increased by 10 %～20 % , the body lengths were increasedby 4 %～6 % , and the hind limb lengths were decreased by 12 %～ 13 % in t reatment group s. PFOS decreased the number of thyroid follicles , in which cell hyperplasia , colloid depletion and vacuolation were observed. These result s suggested that PFOS inhibited the development and increased the growth of X laevis . According to AMA , our result s indicated that PFOS was an anti-thyroid hormone disrupting chemical.

thyroid disrupting chemicals ( TDCs) ; Xenopus laevis ; perfluorooctane sulfonate( PFOS) ; amphibian metamorphosis assay (AMA)

Q948

A

1000-5641(2010)04-0118-07

2009-06

國家自然科學(xué)基金(20877023);上海市自然科學(xué)基金(08ZR1406900);上海市城市化過程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(UPER0606);長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(YRWEF06003)

劉俊奇,女,碩士研究生.

施華宏,男,副教授,研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué).E-mail:hhshi@des.ecnu.edu.cn.