吳劍平，顧欣，李丹妮，嚴(yán)鳳，張鑫

（1.上海市獸藥飼料檢測所，上海， 201103）

高效液相色譜法檢測牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度

吳劍平，顧欣，李丹妮，嚴(yán)鳳，張鑫

（1.上海市獸藥飼料檢測所，上海， 201103）

根據(jù)反相離子對(duì)色譜法的原理，建立了檢測牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度的高效液相色譜方法。前處理使用乙睛沉淀蛋白，堿性氧化鋁SPE柱除去部分水溶性維生素、氨基酸，離心脫脂。以磷酸三乙胺（pH=7.00）∶甲醇=95∶5作為流動(dòng)相，用Agela-ASB C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱溫30℃±2℃，流速0.8 mL/min，以二極管陣列紫外檢測器分析樣品，質(zhì)量濃度范圍在5～500 mg/L內(nèi)線性較好，r＞0.9995。該方法可適用于生鮮乳和巴氏滅菌成品乳，檢測限可達(dá)到0.2 mg/kg，定量凡圍0.5～50 mg/kg，精確度＜10%，回收率＞90%。 范圍0.5～50 mg/kg，精確度＜10%，回收率＞90%。

硫氰酸鈉；高效液相色譜法；反相離子對(duì)色譜法

0 引 言

近幾年，隨著乳品行業(yè)的迅速發(fā)展，乳品的質(zhì)量安全也越來越受重視。牛乳中因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，為微生物提供了良好的生長環(huán)境，因此牛乳極易腐敗變質(zhì)，在牛乳中摻入硫氰酸鈉后可有效的抑菌、保鮮及延長牛乳的保存期。但是，硫氰酸鈉也是毒害品，過量攝入會(huì)對(duì)人體造成危害，在2008年12月，衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第一批）》中明確規(guī)定硫氰酸鈉屬于違法添加物質(zhì)，但至今尚未發(fā)布相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。目前常見的對(duì)牛奶中硫氰酸鹽的檢測方法為離子色譜法，其具有靈敏度高，分離效果好的特點(diǎn)，但是其前處理方法復(fù)雜，回收率也受到影響。高效液相色譜法使用極為廣泛，因此有必要對(duì)研究高效液相色譜法檢測牛奶中的硫氰酸鹽。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（2695-2998二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站）；電子天平（Mettler AE240，瑞士）；高速冷凍離心機(jī) （Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（B-490，BUCHI）；十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（Agela-ASBC18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；堿性氧化鋁SPE固相萃取柱 （Agela-Cleanert,1 000 mg×6mL）； 硫氰酸鈉（98.5%）；磷酸（分析純）；三乙胺（分析純）；乙睛（色譜純）；甲醇（色譜純）；正丙醇（分析純）；去離子水（自制，電阻率＞10 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 磷酸鹽緩沖液與流動(dòng)相溶液制備

量取磷酸2.00 mL置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，倒入燒杯中，逐滴加入三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.00±0.02，制得磷酸鹽緩沖溶液。取950 mL磷酸鹽緩沖液與50 mL色譜級(jí)甲醇混合均勻后，作為流動(dòng)相,抽濾后備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

取硫氰酸鈉對(duì)照品2.50 g，置250 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得1 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 mL置200 mL容量瓶中用1.2.1所制得磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，即得5，10，25，50，100，250，500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agela-ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液︰乙睛=95︰5；柱溫為30℃；流速為0.8 mL/min；檢測波長為218 nm；進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，對(duì)空白、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，典型色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明，硫氰酸鈉的理論塔板數(shù)7623，主峰與雜質(zhì)峰的分離度大于2.0，拖尾因子1.25。根據(jù)3倍信噪比計(jì)算可得其檢測限為1 mg/L，10倍信噪比計(jì)算可得其定量限為3.3 mg/L。

1.2.4 前處理方法

精密量取樣品10.00 mL，置50 mL具塞離心管中，加入乙睛15 mL，密塞強(qiáng)烈振搖提取3 min后，至高速冷凍離心機(jī)中，4℃下8 000 r/min離心3 min，小心取出全部上層清液，過堿性氧化鋁SPE柱，擠干，收集全部流出液于100 mL梨型瓶中，加入1 mL正丙醇，置60℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，精密加入1.00 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩溶解后，取出置2 mL的TIP離心管中，14000 r/min離心3 min脫脂后取水層溶液過0.45 μm濾膜，待測。

2 結(jié) 果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)

在1.2.3色譜條件下，對(duì)空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)，典型色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明，硫氰酸鈉的理論塔板數(shù)不低于5 000，主峰與雜質(zhì)峰的分離度大于2.0，拖尾因子小于1.5。結(jié)果表明，該色譜條件適用于牛奶中的硫氰酸鈉的含量測定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果3倍信噪比計(jì)算可得其儀器檢測限為1 mg/L，10倍信噪比計(jì)算可得其定量限為3.3 mg/L。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 mL置200 mL容量瓶中 用1.2.1所制得磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，即得5，10，25，50，100，250，500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液序列。各取10 μL上機(jī)測定，按1.2.3的色譜條件操作，每個(gè)濃度分別反復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積均值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線序列工作液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線A=18915C–15581，R=0.9999，回歸曲線如圖2所示。 結(jié)果表明，該方法進(jìn)樣質(zhì)量濃度在5～500 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

取生鮮乳3批 （批號(hào)：A-滬浦20101110-11，B-滬金20101029-07，C-滬松20100719-02）， 巴氏滅菌乳（D-三島鮮牛奶20101027，E-光明學(xué)生奶20101024）各取10.00 mL，分別添加5，10，20 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，按1.2.4前處理方法進(jìn)行預(yù)處理，按1.2.3的色譜條件進(jìn)行檢測，所得結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度都符合要求。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)滬浦20101110-11的生鮮乳按1.2.4中的前處理方法制得樣品溶液。取該溶液于分別于室溫下保存0，4，8，12，24 h后以1.2.3儀器方法進(jìn)行測定，KSCN峰面積的RSD分別為0.95%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品溶液中硫氰酸鈉在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇

由于硫氰酸鈉在水中電離成硫氰酸根，硫氰酸根是帶電的強(qiáng)極性物質(zhì)，因此在一般反相色譜柱上很難保留，因此考慮使用離子對(duì)色譜法增強(qiáng)其保留性質(zhì)。一般用于陽離子的離子對(duì)試劑是烷基磺酸類如己烷磺酸鈉等；而用于陰離子的離子對(duì)試劑往往是烷基胺類，如三乙胺，氫氧化四丁基胺等。由于三乙胺同時(shí)也可消除色譜峰拖尾，所以本法選擇磷酸－三乙胺組成的緩沖鹽體系。由于在酸性環(huán)境下三乙胺很難與硫氰酸根形成離子對(duì)化合物，因此將pH值調(diào)節(jié)至7.00。同時(shí)也嘗試了甲醇和乙睛作為有機(jī)相。如圖3所示，結(jié)果表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%磷酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH＝7.00）︰乙睛＝95︰5能取得較好的峰型和系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)。

表1 回收率測定結(jié)果（n=6）

圖3（a）中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸（NaOH飽和溶液調(diào)pH＝7.00）︰乙睛＝90︰10；圖3（b）中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸︰乙睛＝90︰10；圖3（c）中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸︰甲醇＝90︰10；圖3（d）中,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%磷酸︰甲醇＝95︰5。上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的磷酸，三乙胺調(diào)pH值均為7.00。

3.2 凈化方法的選擇

牛奶中干擾硫氰酸鈉檢測的主要雜質(zhì)為蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸和水溶性維生素，因此凈化方法考慮主要能除去這些干擾物質(zhì)。通過加乙睛可以使牛奶中的大部分蛋白質(zhì)變性，發(fā)生絮凝，然后通過高速冷凍離心機(jī)4℃下8 000 r/min離心3 min，使絮凝的蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，同時(shí)也可使部分的脂肪層與水相分離，離心后的提取液中還含有大量氨基酸和水溶性維生素以及部分蛋白質(zhì)，若直接進(jìn)樣檢測雜峰干擾較嚴(yán)重，因此選擇了不同的填料的固相萃取柱進(jìn)行凈化，嘗試了酸性氧化鋁，中性氧化鋁，堿性氧化鋁，氟洛里硅藻土4種填料對(duì)批號(hào)為20101024的學(xué)生奶進(jìn)行凈化后測定質(zhì)量濃度，所得色譜圖如圖4所示，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，堿性氧化鋁柱和中性氧化鋁柱都可以取得較好的回收率，但是從色譜圖來看堿性氧化鋁對(duì)牛奶提取液中的氨基酸和水溶性維生素的吸附效果更好，對(duì)硫氰酸鹽的回收率影響也不大，可以應(yīng)用在凈化方法中。

表2 凈化回收率測定比較結(jié)果表（n=3）

4 結(jié) 論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡便易行，色譜系統(tǒng)適用性良好，方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，可用于生鮮乳和巴氏成品乳中硫氰酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測。其檢測限和定量限都能達(dá)到和離子色譜相同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，而且前處理方法簡便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

[1]朱明華.儀器分析[M].北京：高等教育出版社,2000：70-71.

[2]張玉奎,王杰,張維冰譯.實(shí)用高效液相色譜法的建立[M].北京：華文出版社,2001：377-378.

[3]盛龍生,何麗一,徐連連,等.藥物分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2003：240-242.

Determination of sodium thiocyanate in milk by HPLC

WU Jian-ping,GU Xin,LI Dan-ni,YAN Feng,ZHANG Xin
（Shanghai Institute for Veterinary Drug&Feedstuffs control，Shanghai 201103，China）

A method to determinate sodium thiocyanate in milk by RP-HPLC was established.The separation was performed on Agela-ASB

C18 column（250mm×4.6mm，5 μm）with the mobile phase of phosphoric acid solution（0.2%,V/V,A）：methanol（B）=95∶5.The detection wavelength was 218 nm.The flow rate was 0.8 mL/min and the column temperature was 30℃±2℃.Good linearity was showed within the range of 5～500 mg/L respectively,r＞0.9995.The average recoveries was larger than 90.0%respectively,RSD＜10%.The method was simple,rapid and reliable for the simultaneous determination of sodium thiocyanate in milk with the LOD of 0.2 mg/kg and the determination range of 0.5～50 mg/kg.

sodium thiocyanate﹔HPLC﹔reverse phase ion pair chromatography identification

TS252.7

A

1001-2230（2011）07-0044-03

2011-03-03

吳劍平（1983-），男，畜牧師，研究方向?yàn)闅埩魷y定。