蔣亞男，滿朝新，趙鳳，劉穎，薛玉清，胡惠秩，李博，姜毓君,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086）

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法快速檢測乳中單增李斯特菌

蔣亞男1，滿朝新2，趙鳳1，劉穎1，薛玉清1，胡惠秩1，李博1，姜毓君1,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086）

建立了一種快速檢測滅菌乳中單增李斯特菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)方法。以hlyA基因作為靶基因，對人工污染乳中單增李斯特菌進(jìn)行了LAMP方法的靈敏度試驗(yàn)，同時與PCR方法進(jìn)行比較。并對單增李斯特菌和7種其他乳中常見致病菌進(jìn)行了LAMP檢測，以驗(yàn)證該方法的特異性。結(jié)果表明，LAMP檢測單增李斯特菌的特異性強(qiáng)，檢出限為42 mL-1，其靈敏度比普通PCR高10倍。并且檢測時間比PCR更短，在1.5 h內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。此方法快速、特異、簡單、靈敏，具有較高的推廣價值。關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增；單增李斯特菌；牛乳

0 引言

單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,以下簡稱單增李斯特菌）是重要的食源性致病菌，也是我國乳及乳制品中致病菌檢測指標(biāo)之一[1]。隨著乳及乳制品安全問題被各界廣泛關(guān)注，致病菌的快速檢驗(yàn)和有效鑒定對乳品的質(zhì)量和安全有著重要意義[2]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP），是2000年Notomi T等人研發(fā)的，一種不需要變溫復(fù)制、高效，快速的的核酸擴(kuò)增新方法[3.4]。本研究擬建立一種檢測乳中單增李斯特菌的LAMP方法，特異性的擴(kuò)增該菌的毒力基因hlyA，達(dá)到快速檢測乳及乳制品中的單增李斯特菌的目的。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

單增李斯特菌CMCC54006，銅綠假單胞桿菌ATCC27853，金黃色葡萄球菌ATCC13565，沙門氏菌ATCC14028，英諾克李斯特ATCC33090，蠟樣芽胞桿菌CMCC63303，福氏志賀氏菌CMCC51572，大腸桿菌O157:H7（實(shí)驗(yàn)室保存），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，甜菜堿（Betaine），9700型PCR儀，UVP凝膠成像系統(tǒng)，滅菌乳。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制備

單增李斯特菌和英諾克李斯特菌用胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）培養(yǎng)基、其他實(shí)驗(yàn)菌株用營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基37℃并200 r/min搖床培養(yǎng)12 h，然后用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備DNA模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成

在單增李斯特菌中，由hlyA基因編碼的李氏溶血素（ListeriolysinO，LLO），是單增李斯特菌最主要的致病因子。本研究針對hlyA基因來設(shè)計(jì)LAMP引物（見表1），序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2.3 LAMP方法的建立

將1ml單增李斯特菌液標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC54006）的菌液，用試劑盒提取DNA后，按如下體系和反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)。體系為模板DNA 2 μL，J-FIP和JBIP各1.6 mmol，J-F3和J-B3各0.2 mmol，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.6 mmol，Mg2+（25 mmol）4 uL，Betaine 1mol，Bst酶8 U，滅菌的去離子水補(bǔ)至25 μl。反應(yīng)條件：95℃，5 min，迅速冷卻加入酶，63℃，60 min，80℃，2 min反應(yīng)結(jié)束。

1.2.4 LAMP方法的特異性

對單增李斯特菌CMCC54006和7種其他乳中常見的腸道致病菌：銅綠假單胞桿菌ATCC13565，金黃色葡萄球菌ATCC13565，沙門氏菌ATCC14028，英諾克李斯特ATCC33090，蠟樣芽胞桿菌CMCC63303，福氏志賀氏菌CMCC51572，大腸桿菌O157:H7進(jìn)行培養(yǎng)后，提取其DNA，然后按1.2.3的LAMP反應(yīng)條件和體系，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

1.2.5 LAMP方法檢測滅菌乳的靈敏度

以10倍梯度稀釋的單增李斯特菌對經(jīng)檢驗(yàn)不含單增李斯特菌的滅菌乳進(jìn)行污染，使最終滅菌乳中單增李斯特菌濃度為4.2×108～4.2 mL-1。取1 mL該人工污染的滅菌乳，加入質(zhì)量濃度為250 g/L的檸檬酸鈉150 μL和1 mol/L的氫氧化鈉100 μL，10 000 r／min離心2 min，棄上清；用同體積生理鹽水洗滌沉淀，再10 000 r／min離心1 min[7]。然后用提取細(xì)菌DNA做為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

1.2.6 PCR方法檢測滅菌乳的靈敏度

為了與LAMP檢測滅菌乳中單增李斯特活菌的靈敏度相比較，以1.2.4中DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。其引物為：J-F3和J-B3（見表1）。25 μL反應(yīng)體系：10× PCR Buffer2.5 μL，引物F3和B3各1 μL(10 mmol/L)，2 μL dNTPs(每dNTP 2.5 mmol/L)，0.5 μL(5 U/μL) rTaq DNA聚合酶，2 μL模板,加滅菌的去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為94℃（3 min）預(yù)變性：94℃（30 s），58℃（45 s），72℃（45 s）進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸6 min。

2 結(jié)果

2.1 LAMP方法的建立

為了驗(yàn)證在本研究所建立的LAMP體系和反應(yīng)條件下以及本研究所設(shè)計(jì)的LAMP引物與單增李斯特菌hlyA基因是否匹配、能否有效的擴(kuò)增出LAMP特異性條帶，按1.2.3所述方法進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。

表1 LAMP引物序列[5]

圖1中，M為DNA marker（下同）；1為陰性對照（下同）；2為單增李斯特菌CMCC54006。

由圖1可以看出，1號泳道沒有條帶，而2號泳道出現(xiàn)了由大小不同片段組成的階梯式圖譜，條帶清晰，與理論的LAMP特異性條帶一致，說明了本研究所建立的檢測單增李斯特菌的LAMP方法可行。

2.2 LAMP方法的特異性分析

以單增李斯特菌和7種其他乳中常見致病菌的DNA來檢驗(yàn)本研究所建立的LAMP反應(yīng)的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后,結(jié)果如圖2所示。

圖2中，2～9分別為單增李斯特菌CMCC54006，英諾克李斯特菌ATCC33090，銅綠

假單胞桿菌ATCC13565，沙門氏菌ATCC14028，金黃色葡萄球菌ATCC13565，大腸桿菌O157:H7，蠟樣芽胞桿菌CMCC63303，福氏志賀氏菌CMCC51572。由圖2可以看出，只有泳道2有LAMP特異性條帶，其他泳道都沒有LAMP特異性條帶產(chǎn)生，說明了本研究建立的LAMP方法只針對單增李斯特菌的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，而未對其他幾種常見致病菌的基因產(chǎn)生擴(kuò)增。

2.3 LAMP檢測滅菌乳的靈敏度分析

為了模擬實(shí)際受檢樣品，人工添加單增李斯特菌于滅菌乳中，使滅菌乳中菌濃度分別為4.2×108～4.2 mL-1，然后用試劑盒提取DNA作為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3中，2～10為滅菌乳中單增李斯特菌濃度分別為4.2×108，4.2×107，4.2×106，4.2× 105，4.2×104，4.2×103，4.2×102，42，4.2 mL-1。由圖3可以看出，泳道2～8有LAMP特異性條帶，而泳道10結(jié)果為陰性，表明LAMP檢測滅菌乳中單增李斯特菌的檢出限為42 mL-1。

2.4 PCR檢測滅菌乳的靈敏度分析

為了與LAMP檢測滅菌乳中單增李斯特活菌的靈敏度相比較，以1.2.4中DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。

圖4中，2～10為滅菌乳中單增李斯特菌濃度分別為4.2×108，4.2×107，4.2×106，4.2×105，4.2×104，4.2×103，4.2× 102，42，4.2 mL-1。由圖4可以看出，泳道2～8有LAMP特異性條帶，而泳道9和10結(jié)果為陰性，表明PCR檢測滅菌乳中單增李斯特菌的檢出限為4.2×102mL-1。

3 討論

乳及乳制品中致病菌的檢測方法很多，但目前，企業(yè)和質(zhì)檢部門還是采用傳統(tǒng)的檢測方法（標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法和顯微鏡直接觀察法），檢測的周期長而且操作繁瑣。而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR方法、Real-Time PCR已廣泛應(yīng)用與乳及乳制品中致病菌的檢測中[6-8]，但其需要特殊的儀器才能完成反應(yīng)，而且反應(yīng)時間相對較長等缺點(diǎn)，都制約其技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。LAMP技術(shù)是針對目的基因設(shè)計(jì)4條引物（或6條），在具有鏈置換的Bst酶作用下，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，不需核酸的變溫復(fù)制過程，所以不僅縮短了反應(yīng)時間，同時進(jìn)行高效擴(kuò)增，而且不需要利用復(fù)雜的儀器就能完成操作。

所以找到一些新檢測方法，是科研工作者們孜孜追求的目標(biāo)。而LAMP技術(shù)作為一種的極有應(yīng)用前景的檢測技術(shù)之一，已經(jīng)在檢測食源性致病菌中得到了應(yīng)用[9,10]。本研究建立的檢測滅菌乳中單增李斯特菌的LAMP方法，是通過瓊脂糖電泳檢測來觀察LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。目前除此方法外，還可以向LAMP反應(yīng)液中加入SYBR Green I，通過紫外燈或日光下肉眼進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果判定，如果有擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，反應(yīng)混合物變綠色；反之，則保持橙色不變。此外還可通過觀察焦磷酸鎂（副產(chǎn)物之一）的濁度來檢測，并使用濁度儀來進(jìn)行了定量。

然而，DNA水平的LAMP檢測技術(shù)也存在缺點(diǎn)，比如LAMP方法檢測食品中食源性致病菌，既對活菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時也能擴(kuò)增死菌DNA,故而會過高的評估樣品中實(shí)際存在細(xì)菌量。因此如何改進(jìn)以便能有效區(qū)分死/活細(xì)菌，是LAMP技術(shù)在實(shí)際檢測食源性致病菌工作的發(fā)展趨勢。

4 結(jié)論

本研究以hlyA為靶基因，建立起檢測滅菌乳中單增李斯特菌的LAMP方法。研究表明該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢出限為42 mL-1，比普通PCR方法高10倍，而且檢測周期短，僅需約1.5 h即可完成檢測。該檢測方法效率高、操作簡單、成本低廉，可以廣泛地應(yīng)用到基層單位乳及乳制品檢測中，具有極大地推廣價值。

[1]嚴(yán)劍波,王虹玲,朱水榮,等.單增李斯特菌LAMP方法的建立[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(9):2048-2050.

[2]張守文,尹蕾,周玉玲,乳品中有害微生物的檢測技術(shù)和發(fā)展方向[J].中國乳品工業(yè),2010,38（1）:35-38.

[3]NOTOMI T,OKAYAMA H,MASUBUCHI H,et al.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28 (12):63.

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[10]胡連霞,張偉,張先舟,等.改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌[J].微生物學(xué)報(bào)2009,49(3):378-382.

Rapid detection of Listeria monocytogenes by LAMP technology in sterilized milk

JIANG Ya-nan1,MAN Chao-xin2,ZHAO Feng1,LIU Ying1,XUE Yu-qing1, HU Hui-zhi1,LI Bo1,JIANG Yu-jun1，2
1、Northeast Agricultural University College of Food Science,Haerbin 150030,China；2、National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150086,China)

An assay using Loop-mediated isothermal amplification(LAMP）technology was developed for directly rapid detection of Listeria monocytogenes in sterilized milk.We chosed the gene hlyA of L.monocytogenes as target gene and amplified the gene by LAMP in sterilized milk,The sensitivity of LAMP was compared with the PCR method,Listeria monocytogenes and seven other intestinal bacterias were detected for specificity by LAMP.The specificity of LAMP was higher,The detection sensitivity of Listeria monocytogenes in sterilized milk was 42 mL-1by LAMP,It’s sensitivity was 10 times than the PCR method,Only 1.5 h was expent to finish the whole test.So the method was rapid,specific,simple,and with high value of promotion.

Loop-mediated isothermal amplification;Listeria monocytogenes;milk

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0045-03

2011-01-15

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009BADB9B06）。

蔣亞男（1985-），女，碩士研究生，食品微生物與生物技術(shù)。

姜毓君