滕道祥, 馬利華, 秦衛(wèi)東

(1.徐州工程學(xué)院 數(shù)理學(xué)院,江蘇 徐州 221008;2.徐州工程學(xué)院 食品學(xué)院,江蘇 徐州 221008)

自由基是生物體內(nèi)有關(guān)酶促系統(tǒng)需氧代謝過程和電子傳遞鏈中電子傳遞的中間產(chǎn)物,是生物體組織或細(xì)胞經(jīng)歷某些病理損害過程的中間產(chǎn)物。生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、體內(nèi)自身清除系統(tǒng)的活力或藥物清除作用的發(fā)揮與疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有直接關(guān)系,因此從自由基清除、抗氧化方面探討食品清除自由基、增強(qiáng)抗氧化的活性,開發(fā)、研制一些新型天然抗氧化劑已受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì),是植物的次生代謝產(chǎn)物,具有清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射等生物活性功能[2,3],因此,開發(fā)和利用植物多酚具有重要意義。牛蒡系菊科牛蒡?qū)僦参?學(xué)名Arctum Iappa L,是民間傳統(tǒng)的藥用植物,含有豐富的多糖、多酚等具有生物活性的物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,具有清除體內(nèi)垃圾、促進(jìn)細(xì)胞活性、延緩衰老的作用,是徐州地區(qū)出口創(chuàng)匯主要特種保健型蔬菜之一[4]。

本實(shí)驗(yàn)以牛蒡?yàn)樵?提取多酚物質(zhì),采用大孔樹脂層析法對(duì)牛蒡多酚進(jìn)行純化,并利用EPR技術(shù),檢測(cè)牛蒡多酚清除DPPH自由基能力,以期開發(fā)一種具有良好生理活性的新的植物多酚材料,同時(shí)為拓展牛蒡深加工產(chǎn)品領(lǐng)域、綜合利用牛蒡資源提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛蒡(市售);大孔樹脂 NKA-9、S-8、AB-8、D2040(南開大學(xué)化工廠);鐵氰化鉀、三氯乙酸、水楊酸、95%乙醇,為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JES-FA200電子自旋共振儀及配套設(shè)備:石英標(biāo)準(zhǔn)樣品管(內(nèi)徑為4 mm),微波發(fā)生器,Data Process,均購置于日本JEOL公司;DHG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);FZ102微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);7230G可見分光光度計(jì)、FA2104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);PC-1000電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.3 方 法

1.3.1 牛蒡多酚的提取

稱取10 g自制牛蒡粉,加入120 mL 70%乙醇,在90℃水浴鍋中回流提取40 min,抽濾后得質(zhì)量濃度為0.560 2 mg/mL溶液,備用。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

大孔樹脂經(jīng)乙醇、5%NaOH溶液沖洗、乙醇浸泡、5%的HCl沖洗及蒸餾水沖洗至中性。

1.3.3 牛蒡多酚的分離純化

(1)靜態(tài)吸附。準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于6 g干重預(yù)處理過的大孔樹脂 NKA-9、S-8、AB-8、D2040的濕樹脂,放入燒杯中,加入牛蒡粗提液,定期測(cè)定液體的吸光度,直至吸光度值保持不變,測(cè)定其吸附量、吸附率、解吸附率[5],計(jì)算公式為:

其中,ρ0、ρ分別為吸附前、后溶液中牛蒡多酚的質(zhì)量濃度;V為提取液的體積;m為樹脂質(zhì)量。

其中,V為洗脫劑總體積;ρ為洗脫液中牛蒡多酚的質(zhì)量濃度;m為靜態(tài)吸附總量。

(2)動(dòng)態(tài)吸附。將樹脂活化后,稱取40 g,裝入2.0×40.0 cm柱。待樹脂柱平衡后,加入多酚提取液80 mL,按照一定的流速分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,收集流出液并測(cè)定其吸光度,計(jì)算吸附量為:

其中,ρ0為上柱前料液中牛蒡多酚質(zhì)量濃度;ρ為流出液中牛蒡多酚質(zhì)量濃度;V為流出液總體積;m為樹脂質(zhì)量。

(3)流速對(duì)吸附效果的影響。稱取活化后的樹脂裝柱,提取液以不同的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,收集流出液并測(cè)定其吸光度、計(jì)算吸附量,考察流速對(duì)樹脂吸附效果的影響。

(4)提取液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響。稱取活化后的樹脂裝柱,以不同質(zhì)量濃度的提取液按照1 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,收集流出液并測(cè)定其吸光度,計(jì)算吸附量,考察提取液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響。

(5)動(dòng)態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)。動(dòng)態(tài)解吸附率是指用洗脫劑對(duì)吸附后的大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸附時(shí),洗脫劑解吸附出被吸附物質(zhì)的質(zhì)量與被吸附物質(zhì)的總質(zhì)量之比,即:

其中,V為洗脫劑總體積;ρ為洗脫流出液中牛蒡多酚質(zhì)量濃度;m為動(dòng)態(tài)吸附量。

(6)洗脫速度對(duì)純化效果的影響。稱取活化后的樹脂裝柱,解吸附速度分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min 進(jìn)行解吸附 ,解吸附平衡時(shí)分別記下洗脫劑用量,計(jì)算其解吸附率。

(7)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)純化效果的影響。以2 mL/min速度,分別用 30%、60%、70%、80%、95%乙醇進(jìn)行洗脫,計(jì)算其解吸附率。

1.3.4 牛蒡中多酚測(cè)定

分別移取不同預(yù)處理物料的提取液1.00 mL置于容量瓶中,各加入1 mol/L NaAc和1 mol/L HAc(體積比 3∶1)溶液 3 mL,再加0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL,95%乙醇稀釋至25 mL,放置20 min,在430 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

提取率=提取液質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)×(提取液體積/測(cè)定時(shí)使用體積)/原料質(zhì)量。

1.3.5 DPPH體系制備

稱取0.012 8 g DPPH加水溶解于小燒杯中,移至50 mL容量瓶,定容,搖勻。將牛蒡多酚溶液稀釋 100 倍后,分別取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL牛蒡多酚溶液,按表 1所列方式加樣。

表1 DPPH自由基實(shí)驗(yàn)加樣表

樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力(scavenging activity,簡(jiǎn)稱SA)可表示為:

其中,A0、Ai、Aj表示體系中各種加樣 EPR譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量的平均值。

以上3種試劑各取5 μ L打入 EP管,混勻后立即裝入石英毛細(xì)管中,然后外加樣品保護(hù)測(cè)試管,一并放入EPR波譜儀的諧振腔中進(jìn)行測(cè)定,在此之前應(yīng)將空樣品管放入諧振腔中檢測(cè)有無雜質(zhì)信號(hào),根據(jù)計(jì)算機(jī)顯示的譜線來旋轉(zhuǎn)調(diào)整樣品位置,位置選好之后,調(diào)整參數(shù)進(jìn)行測(cè)量[7]。

1.3.6 半清除率(EC50)的測(cè)定

半清除率指清除率為50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度,根據(jù)不同質(zhì)量濃度樣品的清除率作曲線求出。所需質(zhì)量濃度越低,半清除率越高,表明該物質(zhì)抗氧化性能越好[8]。

問卷調(diào)查共4道題，分值計(jì)量采取1-5分，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。第一道題調(diào)查實(shí)驗(yàn)對(duì)象的詞匯學(xué)習(xí)頻率，因?yàn)轭l率是詞匯習(xí)得率的一個(gè)關(guān)鍵因素，重復(fù)頻率越高，習(xí)得率越高。調(diào)查問卷問題和數(shù)據(jù)分析結(jié)果如下（表4）

1.3.7 EPR測(cè)試條件

掃描時(shí)間2 min;中心磁場(chǎng)321.0 mT;掃描寬度50 mT;微波頻率9 044.613 MHz;微波功率20 mW;g 2.011。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果

用 NKA-9 、S-8、AB-8、D2040 樹脂經(jīng)預(yù)處理后,分別稱取5 g放在100 mL燒杯中,分別加入50 mL提取液,達(dá)到吸附平衡后,計(jì)算飽和吸附量和吸附率。將已處理好的樹脂經(jīng)靜態(tài)飽和吸附后濾出,加入70%乙醇50 mL,達(dá)到靜態(tài)洗脫平衡,測(cè)定洗脫液的體積分?jǐn)?shù),計(jì)算解吸附率,其結(jié)果見表2所列。由表2可看出,4種樹脂中AB-8樹脂為最佳的吸附分離載體。

表2 4種樹脂靜態(tài)吸附、解吸附性能

2.2 動(dòng)態(tài)吸附

2.2.1 動(dòng)態(tài)吸附流速的確定

稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂裝柱、裝入濃縮液,控制流速在 0.5、1.0、1.5 、2.0、2.5 mL/min上柱吸附,考察上柱流速對(duì)吸附牛蒡多酚的影響,結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,上柱流速為1.0 mL/min時(shí)牛蒡多酚吸附量最大。

圖1 流速對(duì)吸附牛蒡多酚的影響

2.2.2 提取液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

以不同質(zhì)量濃度的提取液,以1 mL/min的流速進(jìn)入AB-8樹脂柱中進(jìn)行吸附試驗(yàn),收集流出液,測(cè)定其吸光度,考察上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 上柱液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

由圖2可看出,上柱液中牛蒡多酚的質(zhì)量濃度越高,樹脂處理的溶液量就越小,吸附效果就越差。AB-8吸附樹脂的吸附量在上樣初始質(zhì)量濃度為1.68 mg/mL時(shí)吸附量最大。

2.3 動(dòng)態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)

2.3.1 解吸附速度對(duì)解吸附效果的影響

解吸附速度分別為 1.0、1.5 、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min時(shí)進(jìn)行解吸附,計(jì)算解吸附率如圖3所示。由圖3可以看出,以AB-8樹脂動(dòng)態(tài)解吸附牛蒡多酚時(shí),解吸附速度應(yīng)控制在2 mL/min相對(duì)較好。

圖3 解吸附速度對(duì)AB-8樹脂解吸附效果的影響

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸附效果的影響

分別以 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為洗脫液,按2 mL/min進(jìn)行解吸附,計(jì)算解吸附率,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸附效果的影響如圖4所示。由圖4可看出,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時(shí),解吸附率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而升高,但體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)就隨其體積分?jǐn)?shù)的增加而下降。因此,乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),對(duì)牛蒡多酚的解吸附效果最好。

圖4 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸附效果的影響

2.4 純化效果

稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂裝柱、裝入濃縮液,采用初始質(zhì)量濃度為1.68 mg/mL上樣,以流速1.0 mL/min吸附,吸附完畢后,以70%乙醇溶液解吸附,速度2.0 mL/min,將牛蒡多酚提取液純化,測(cè)定純化前與純化后牛蒡多酚提取液中多酚的質(zhì)量濃度,比較純化的效果,如圖5所示。

圖5 純化效果的比較

由圖5看出,大孔樹脂純化效果明顯,牛蒡提取液經(jīng)過大孔樹脂純化后,牛蒡多酚質(zhì)量濃度提高了55.36%。

2.5 EPR測(cè)定牛蒡多酚清除DPPH自由基

分別取不同體積純化前后的牛蒡多酚溶液各5 μ L打入EP管,與DPPH 自由基溶液混勻后立即裝入石英毛細(xì)管中,放入EPR波譜儀的諧振腔中進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖6所示。圖6表明,純化前后,隨著牛蒡多酚質(zhì)量濃度的提高,DPPH自由基在EPR圖譜中譜信號(hào)強(qiáng)度均逐漸降低,說明牛蒡多酚對(duì)DPPH自由基有一定的清除效果。

圖6 牛蒡多酚清除DPPH自由基EP R圖譜

純化前后質(zhì)量濃度為56～336 μ g/mL時(shí),隨著牛蒡多酚質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基的清除率均在不斷提高,且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系,如圖7所示。其線性方程為:

圖7 不同質(zhì)量濃度牛蒡多酚與清除率的關(guān)系

通過計(jì)算,半數(shù)清除率(EC50)純化前為202.04 μ g/mL,純化后為 154.73 μ g/mL,純化前后EC50的比較如圖8所示。從圖8可看出,清除率降低了23.42%,其抗氧化能力明顯提高了。

圖8 純化前后EC50的比較

3 結(jié)束語

大孔樹脂AB-8為牛蒡多酚純化的最佳處理樹脂。最佳純化條件如下:上柱流速為1.0 mL/min、上樣初始質(zhì)量濃度為1.68 mg/mL時(shí)吸附量最大;70%乙醇為最佳洗脫劑,以2.0 mL/min速度解吸附效果最好,純化后牛蒡多酚的質(zhì)量濃度提高了55.36%。

本實(shí)驗(yàn)的研究表明,大孔樹脂再生后可反復(fù)利用,工藝簡(jiǎn)單,成本低,適用于工業(yè)化大生產(chǎn)[2],牛蒡經(jīng)過大孔樹脂處理后,多酚物質(zhì)的質(zhì)量濃度以及抗氧化能力均有所提高。且EPR技術(shù)具有靈敏度高、樣品不受破壞和無干擾等優(yōu)點(diǎn),適用于增抑自由基能力的研究[9]。

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