孟艷芬,段長松,王錫樂,熊小路,溫博海

黑龍江立克次體感染血管內皮細胞的初步研究＊

孟艷芬,段長松,王錫樂,熊小路,溫博海

目的 通過黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endo thelial cells,HUVEC)探討其在內皮細胞內的生長規(guī)律。方法將泛影葡胺密度梯度超速離心純化的黑龍江立克次體(HLJ-054株)感染體外培養(yǎng)的 HUVEC,通過間接免疫熒光和掃描電鏡檢測與觀察不同時相黑龍江立克次體在內皮細胞內的生長狀況。熱滅活黑龍江立克次體做平行對照。結果立克次體粘附并侵入內皮細胞,在感染后第6 h及第24 h分別為感染高峰;感染5 d后細胞內立克次體逐漸增殖,第8～9 d細胞內立克次體急劇增殖,并見細胞核內有少量立克次體,細胞出現(xiàn)病變,第12 d細胞內充滿立克次體,大部分細胞皺縮脫落。結論黑龍江立克次體能夠感染血管內皮細胞,在血管內皮細胞內不斷增殖而使細胞死亡。

黑龍江立克次體;血管內皮細胞;細胞病變

立克次體屬為α-變形菌綱(α-p roteobacteria)的一類專性細胞內寄生的革蘭陰性菌,分為斑點熱群(Spotted fever group,SFG)和斑疹傷寒群(Typhus group,TG),分別引起斑點熱和斑疹傷寒。斑點熱是重要的人獸共患病,經(jīng)典的斑點熱有立氏立克次體引起的落磯山斑點熱、康氏立克次體引起的地中海斑點熱(鈕扣熱)、西伯利亞立克次體引起的北亞熱、澳大利亞立克次體引起的昆士蘭斑點熱、小蛛立克次體引起的立克次體痘等[1-2]。近30年來在世界各地新發(fā)現(xiàn)了10多種斑點熱立克次體,我國已在至少10多個省、市、自治區(qū)證實有斑點熱立克次體感染,并從新疆、內蒙古、黑龍江、吉林、北京等地的病人和/或蜱體內分離到斑點熱立克次體[3],分子生物學研究證實從新疆、內蒙古、北京分離的斑點熱立克次體為西伯利亞立克次體,而從黑龍江、吉林分離的立克次體為——斑點熱立克次體新種——黑龍江立克次體(Rickettsia heilongjiangensis)[4]。

黑龍江立克次體是我國1982年首先從黑龍江綏芬河的森林革蜱(Derm acentor silvarum)分得的一斑點熱群立克次體新種,1996年又從東北病人血液首次分離到該病原體,證實其對人的致病性。2003年俄羅斯亦發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體感染的急性蜱傳斑點熱患者和從蜱樣本中擴增到該立克次體DNA[5-6]。黑龍江立克次體引起的蜱傳斑點熱被WHO命名為“遠東蜱傳斑點熱”[7],為新發(fā)現(xiàn)的人獸共患病。

斑點熱立克次體可以在體外培養(yǎng)的真核細胞(上皮細胞如綠猴腎上皮細胞即Vero細胞,成纖維細胞如雞胚成纖維細胞,內皮細胞及造血細胞系等)內生長繁殖,但其在體內主要侵犯血管內皮細胞[8-9]。斑點熱的發(fā)病主要是由攜帶立克次體的蜱直接叮咬皮膚,進入體內,首先侵染血管內皮細胞。斑點熱立克次體通過其表面外膜蛋白A和B(rOmpB和 rOmp A)與血管內皮細胞表面受體Ku70結合而侵入血管內皮細胞。斑點熱立克次體在宿主細胞質內生長繁殖,以其RickA蛋白誘導宿主細胞骨架肌動蛋白聚合形成肌絲,推動立克次體從細胞內釋放感染相鄰細胞,引起血管損傷[8-12]。斑點熱立克次體感染的臨床表現(xiàn)主要由全身血管內皮細胞損傷所致,引起急性血管炎、血管周圍炎及相應器官病變。

微血管內皮細胞為斑點熱群立克次體的靶細胞。本文采用體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(human um bilical vein endo the lial cells,HUVEC)作為黑龍江立克次體的宿主細胞,通過間接免疫熒光抗體染色檢測和掃描電鏡觀察,分別測定不同時相黑龍江立克次體在宿主內皮細胞的數(shù)量,分析黑龍江立克次體感染內皮細胞及其在內皮細胞的生長增殖規(guī)律,為進一步研究黑龍江立克次體的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黑龍江立克次體054株感染雞胚卵黃囊膜,為本室保存。

1.1.2 感染血清 黑龍江立克次體054株感染BALB/c小鼠21 d血清。

1.1.3 細胞 Vero細胞由本室保存,HUVEC由本室分離、培養(yǎng)。

1.1.4 細胞培養(yǎng)液 RPM I-1640培養(yǎng)液(Hy-Clone),胎牛血清(HyClone),膠原酶Ⅰ型(Gibco),0.25%胰蛋白酶(HyClone),內皮細胞培養(yǎng)液及內皮細胞生長添加劑(ScienCell),青、鏈霉素(Hy-Clone)、NaHCO3(HyClone),HEPES(HyClone),腦心浸液(Becton Dickinson)。

1.2 方法

1.2.1 黑龍江立克次體培養(yǎng)及純化[13]復蘇Vero細胞,加入含10%胎牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)液(p H 7.2),置37℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)長至細胞單層,分瓶傳代培養(yǎng)。用3.7%腦心浸液研磨黑龍江立克次體感染的雞胚卵黃囊膜,制備適當濃度的卵黃囊膜懸液,用10%懸液感染C3H/HeN小鼠,第3 d取小鼠脾臟,研磨成細胞懸液,200鉬銅網(wǎng)過濾后感染無青、鏈霉素培養(yǎng)液(含2%～5%FBS)培養(yǎng)的Vero細胞單層,感染24 h后棄上清,加入新鮮培養(yǎng)基,置33 ℃、5%CO2孵箱內繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d,倒置顯微鏡下見細胞單層出現(xiàn)空斑,Giménez染色檢測可見Vero細胞內黑龍江立克次體散在分布。將傳代擴大培養(yǎng)的正常Vero細胞與黑龍江立克次體感染的Vero細胞混懸共培養(yǎng),當細胞內黑龍江立克次體感染嚴重時富集細胞。富集的Vero細胞,經(jīng)玻璃珠破碎,3 000 r/min離心20 min去除細胞碎片,17 000 r/min離心1 h富集黑龍江立克次體。將富集的黑龍江立克次體制成懸液,過泛影葡胺密度梯度,超速離心后得到純化的黑龍江立克次體,分裝并保存于-70℃冰箱備用?？瞻哂嫈?shù)定量純化的活的黑龍江立克次體[14-16],為 1.2×107PFU/m L。

1.2.2 HUVEC培養(yǎng)[17]將正常產(chǎn)后6h內、健康新生兒臍帶放入含1%青、鏈霉素的無菌 PBS中,4℃保存。在生物安全柜,剪除臍帶破損、夾痕、血腫部分,臍靜脈一端插入與三通管接通的平針頭,用止血鉗固定,PBS沖洗臍靜脈至無血跡。臍靜脈另一端用止血鉗夾閉固定,向臍靜脈內灌注0.1%Ⅰ型膠原酶溶液,使臍靜脈完全充盈,37℃水浴孵育15～20 m in。孵育完畢,收集臍靜脈內消化液,用PBS沖洗臍靜脈1次,將洗液一并收集到50 m L離心管。1 200 r/m in離心10 min,棄上清,洗細胞1遍,向細胞沉淀中加入內皮細胞培養(yǎng)液(含5%胎牛血清、內皮細胞基礎培養(yǎng)液 ECM、內皮細胞生長添加劑 ECGS 100 U/m L青霉素、100μg/mL鏈霉素),用吸管輕輕吹打制成均勻的細胞懸液,接種于25 mL細胞培養(yǎng)瓶,置37 ℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)24 h換新鮮培養(yǎng)液,以后每2～3 d換液。原代培養(yǎng)的 HUVEC長滿培養(yǎng)面80%以上時,棄細胞上清,用PBS洗細胞1遍,用1 m L 0.25%胰蛋白酶室溫消化2～3 min后棄胰蛋白酶,加入含血清的培養(yǎng)液終止胰酶消化。用吸管輕輕吹打使貼壁細胞完全脫落,收集細胞懸液,1 200 r/min離心10 min后棄上清,加入內皮細胞培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.2.3 黑龍江立克次體感染 HUVEC 將3代培養(yǎng)的HUVEC作為實驗細胞。消化 HUVEC單層細胞成懸液,接種至鋪有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板,待 HUV EC在蓋玻片上長至單層,分別用活或熱滅活的黑龍江立克次體與 HUV EC(MO I=200∶1)共培養(yǎng),置33 ℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)24 h后棄細胞上清,再加入細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在此后1～24 h及 2～12 d取出蓋玻片,用黑龍江立克次體感染小鼠21 d血清作間接免疫熒光檢測(IFA),計算黑龍江立克次體感染指數(shù)及評價黑龍江立克次體在內皮細胞的增殖水平。黑龍江立克次體感染指數(shù)=每個細胞含立克次體均數(shù)×感染細胞百分率×100[18]。

1.2.4 掃描電鏡觀察 于24孔細胞培養(yǎng)板取出立克次體感染 1 d、3 d、5 d、9 d、12 d 的內皮細胞蓋玻片,浸入PBS輕輕洗細胞表面,將細胞蓋玻片放入含有固定劑的小瓶,在4℃固定2 h;吸出固定劑,PBS輕洗2次(每次10 min),再用預冷的10 g/L鋨酸在4℃固定1 h;用 PBS輕洗2次后用系列梯度乙醇脫水(乙酸異戊酯置換),經(jīng) CO2臨界點干燥后將細胞片置掃描電鏡觀察內皮細胞內立克次體。

2 結 果

2.1 黑龍江立克次體感染 HUV EC 用純化的活黑龍江立克次體感染爬片生長的 HUVEC,分別在第 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 取出蓋玻片 ,IFA 檢測內皮細胞內立克次體,結果顯示1～3 h內皮細胞內立克次體感染數(shù)較少,僅有約10%細胞感染,平均每個細胞內含黑龍江立克次體<1;在感染后6 h和24 h時,各出現(xiàn)一個感染高峰,IFA檢測顯示感染后第24 h約85%內皮細胞被感染。滅活黑龍江立克次體與內皮細胞共同培養(yǎng),結果顯示內皮細胞內立克次體數(shù)亦無明顯增加(圖1A)。

圖1 黑龍江立克次體感染內皮細胞效率(A)及黑龍江立克次體在內皮細胞內生長曲線(B)Fig.1 R.heilong jiangensis infected HUVECs during 24 hours(A)and grew in HUVECs during 12 days(B)

2.2 黑龍江立克次體在 HUVEC內生長 黑龍江立克次體以感染爬片生長的 HUV EC 24 h后棄細胞上清,加入新的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將立克次體感染內皮細胞24 h定為0 d,其后每天取感染細胞熒光染色鏡檢。感染后第1 d,平均每個細胞內含

5～10個立克次體;感染后第1～4 d,細胞內立克次體未見明顯增殖,但第5～7 d細胞內立克次體數(shù)逐漸增加,宿主細胞未見明顯病變;第8～9 d細胞內立克次體急劇增加,并可見細胞胞核內有少量立克次體;第12 d胞質內彌漫立克次體,細胞由梭形變成瘦長形(圖1B;圖2);第15 d,大部分細胞皺縮脫落或破碎,懸浮細胞及碎片染色鏡檢可見大量立克次體。滅活黑龍江立克次體與內皮細胞共培養(yǎng),染色鏡檢僅見細胞內含極少量立克次體,第5～7 d細胞內基本觀察不到立克次體。

2.3 掃描電鏡觀察黑龍江立克次體感染 HUVEC黑龍江立克次體感染細胞后1～3 d,可見立克次體存在于內皮細胞胞質中,當立克次體進入胞質,以游離狀態(tài)分散于胞質內,菌體外周有一層電子密度低的“環(huán)帶”將立克次體與宿主細胞胞質分隔開。感染5 d后,立克次體感染細胞增多,細胞內立克次體數(shù)量明顯增加,立克次體感染細胞胞膜形成突觸,相鄰受感染的細胞胞膜凹陷將立克次體攝入胞質。處于分裂狀態(tài)的立克次體長短不等,呈桿狀、棒狀,均以二分裂方式繁殖,還可見立克次體互相縱行連接成鏈狀結構,鏈狀結構可含有3個或4個形態(tài)相似的立克次體。電鏡下觀察到細胞胞核內存在立克次體,胞核內立克次體一般出現(xiàn)在感染5d后的細胞內(圖 3)。

3 討 論

斑點熱立克次體的宿主細胞為內皮細胞,為了研究黑龍江立克次體與宿主內皮細胞的相互作用,我們分離、培養(yǎng)原代人臍靜脈內皮細胞,傳代培養(yǎng)3代的內皮細胞作為黑龍江立克次體感染宿主細胞。用黑龍江立克次體感染內皮細胞24 h后,去除細胞上清,添加新鮮無青、鏈霉素的內皮細胞培養(yǎng)液,觀察黑龍江立克次體感染內皮細胞及其在內皮細胞的生長繁殖規(guī)律。結果顯示黑龍江立克次體與內皮細胞共培養(yǎng)24 h內,在第6 h及第24 h各出現(xiàn)一個感染高峰,與在3～7 h和24 h各出現(xiàn)一個感染高峰的立氏立克次體感染人臍靜脈內皮細胞的結果基本一致[19]。

圖2 IFA檢測黑龍江立克次體感染內皮細胞A:感染后12 h,內皮細胞攝入立克次體;B:感染5d后,細胞內立克次體逐漸增多,但內皮細胞繼續(xù)分裂增殖;C:立克次體呈棒狀,處于即將分裂狀態(tài);D:少量立克次體進入內皮細胞胞核內;E:感染后9 d,立克次體互相縱行連接成鏈狀結構,鏈狀結構可含有3個或4個立克次體;F:感染后10 d,細胞由梭形變成瘦長形,含大量立克次體。Fig.2 R.heilong jiangensis infected HUVECs revealed by indirect immunofluorescence assay A:internalization of rickettsiae by the endothelial cell at 12h postinfection;B:cell proliferation with more rickettsiae;C:long rod-shape forms of rickettsiae thatwould divided;D:transmitted and entry into the nuclei of rickettsiae;E:rickettsiae formed a chain-shape by three o r four organism s in cytop lasm on day 9 postinfection;F:HUVECs became long and thin with high load of rickettsiae

黑龍江立克次體進入內皮細胞后,能夠在內皮細胞生長繁殖,并且維持較長的增殖時間。為了解黑龍江立克次體在內皮細胞的生長規(guī)律,本研究用IFA及掃描電鏡觀察,分析黑龍江立克次體在內皮細胞內12 d的生長繁殖規(guī)律。從感染后第1 d到第4 d,黑龍江立克次體在內皮細胞內無顯著增殖,IFA檢測可見細胞內少量立克次體散在分布于細胞質。第5～9 d立克次體在內皮細胞以二分裂方式快速增殖,立克次體數(shù)量急劇增加,并且內皮細胞核

圖3 掃描電鏡觀察黑龍江立克次體感染內皮細胞A:立克次體從感染細胞釋放感染鄰近細胞;(B,C):位于胞內的立克次體外周包裹低密度物質,正在分裂及分裂形成鏈狀排列的立克次體;(D,E):3 000倍及1 500倍電鏡下立克次體分布在胞質及胞核;F:內皮細胞胞質皺縮,立克次體密集成團。Fig.3 R.heilong jiangensis infected HUVEC observed under scanning electron m icrographs(SEM)A:rickettsiae sp read from the infected cells to normal cells;(B,C):intracellular rickettsiae coated with low electron density materials;(D,E):intracellular rickettsiae p roliferated and formed chains;rickettsiae existed in cytop lasm and nuclei at low power of SEM(E);F:an intensive cluster of rickettsiae was observed in cytoplasm at high power of SEM.

內出現(xiàn)立克次體侵入,立克次體在內皮細胞大量增殖,倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)無明顯改變,IFA及掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體使細胞形成突觸釋放感染相鄰細胞,即通過細胞間播散感染相鄰細胞。第10 d檢測,內皮細胞由梭形貼壁伸展生長逐漸呈瘦長形,胞質內充滿立克次體,每個細胞內立克次體超過100個,細胞核內立克次體亦有增多。感染后第12 d,大部分內皮細胞變圓脫落,懸浮于細胞培養(yǎng)基,將脫落的內皮細胞離心甩片做 IFA檢測,可見內皮細胞內有大量立克次體,并可見內皮細胞碎片及碎片中也帶有立克次體,在細胞上清中也發(fā)現(xiàn)大量立克次體。這是由于立克次體在細胞內大量繁殖致使細胞裂解,立克次體釋放到細胞上清中。

立克次體病是一類嚴重威脅人類健康的人獸共患自然疫源性疾病。斑點熱群立克次體是以侵犯血管內皮細胞為主使人致病的細胞內寄生病原菌。斑點熱群立克次體感染微血管內皮細胞,首先要接觸、粘附內皮細胞,然后侵入內皮細胞,但其機制值得進一步研究。黑龍江立克次體是我國首次發(fā)現(xiàn)的斑點熱群立克次體新種,我們也將采用新的技術和方法進一步研究黑龍江立克次體如何與內皮細胞相互作用,發(fā)現(xiàn)我國斑點熱立克次體的致病相關毒力分子,在細胞和分子水平上進一步闡明黑龍江立克次體致病機理。

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Primary study on Rickettsia heilong jiangensis infection of vascular endothelial cells

M ENG Yan-fen,DUAN Chang-song,WANG Xi-le,XIONG Xiao-lu,WEN Bo-hai

(State Key Laboratory of Pathogens and Biosecurity,Institute of Microbiology and Epidem iology,Beijing 100071,China)

The Rickettsia heilongjiangensis organisms purified by Renografin renografin gradient centrifugation were app lied to infected human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)grow n in monolayer on cover slips.Rickettsiae were examined by both indirect immune fluorescence assay(IFA)and scanning electron micrograph(SEM)after rickettsial infection.During the first 24 hours postinfection(ip),two infection peaks were found at 6 and 24 hours pi,respectively.Multip lication of rickettsiae and pathological changes of host cells wereob served at 5 days pi,while the amount of intracellular rickettsiae was markedly increased within 5 to 9 days pi.A few of rickettsiae were observed in the nucleus of host cells that appeared severe pathological changes within 8 to 9 dayspi.Due to the overw helming rickettsial infection,most of the infected host cells shed 12 days pi.Our results demonstrated that R.heilong jiangensis has a capability to infect vascular endo the lial cells to cause vascular injury of humans.

Rickettsia heilong jiangensis;vascular endothelial cells;pathological change

R376

A

1002-2694(2011)06-0470-05

＊國家基礎研究計劃(973計劃課題 2010CB530200/2010CB530205)和國家科技重大專項(重大傳染病預防與控制課題2008ZX10004-002)聯(lián)合資助

溫博海,Email:bohaiwen@sohu.com

軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國家重點實驗室,北京 100071

2011-03-02;

2011-03-22