原子力顯微鏡掃描成像DNA分子

冉詩(shī)勇，王艷偉，楊光參

（溫州大學(xué) 物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州325035）

1 引 言

1982年，IBM瑞士蘇黎士實(shí)驗(yàn)室的賓尼（Gerd Binning）和羅雷爾（Heinrich Rohrer）研制出世界上第一臺(tái)掃描隧道顯微鏡（STM）［1］，STM使人類能在原子或分子的尺度上觀察甚至操縱原子，他們也因此獲得了1986年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)．STM要求掃描樣品是導(dǎo)電材料，應(yīng)用上受到了限制．為了拓寬應(yīng)用范圍，1986年賓尼在STM的基礎(chǔ)上發(fā)明了原子力顯微鏡（AFM）［2］．AFM對(duì)樣品無(wú)特別要求，一經(jīng)發(fā)明就在各領(lǐng)域研究特別是在生物大分子（如DNA、蛋白質(zhì)）掃描成像研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用．

傳統(tǒng)的近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)一般引入STM掃描實(shí)驗(yàn)［3－5］，所用樣品一般是成品，學(xué)生親自動(dòng)手制備樣品可行性較小．與之相比，AFM樣品制備的簡(jiǎn)便性使樣品制備這一流程引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)成為可能．已往的科學(xué)研究中已積累了不少的生物大分子 AFM 成像技術(shù)［6－11］．我們?cè)诮陙?lái)的近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，將生物物理研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)如單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)［12］、AFM等融入近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)和本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)，取得了一定的教學(xué)效果．本文將先介紹AFM的基本原理，然后介紹AFM用于DNA分子掃描成像的實(shí)驗(yàn)，著重于樣品制備技術(shù)和實(shí)驗(yàn)步驟．該實(shí)驗(yàn)既能讓學(xué)生掌握AFM的原理，又能讓他們學(xué)習(xí)一些基本的AFM掃描用生物樣品制備方法．

2 實(shí)驗(yàn)原理

2．1 裝置原理

AFM利用微懸臂上的探針尖端充當(dāng)力傳感器．圖1（a）為常用探針的光學(xué)顯微鏡成像，（b）為側(cè)面圖．針尖與樣品之間的作用力會(huì)使懸臂偏轉(zhuǎn)．因此當(dāng)激光照射在微懸臂的末端時(shí)，其反射光的位置也會(huì)因?yàn)閼冶燮D(zhuǎn)而改變，造成偏移量的產(chǎn)生．系統(tǒng)利用四象限探測(cè)器將偏移量記錄下并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)．以供控制器作信號(hào)處理（圖2）．AFM檢測(cè)到懸臂的偏轉(zhuǎn)后，可以工作在恒高或恒力模式下得到形貌圖像數(shù)據(jù)．在恒高模式下，掃描器的高度是固定的，根據(jù)懸臂的形變信號(hào)轉(zhuǎn)換成形貌圖像，該模式一般用于原子級(jí)別平整度樣品成像．在恒力模式下，懸臂偏轉(zhuǎn)信號(hào)輸入到反饋電路，反饋系統(tǒng)根據(jù)信號(hào)相應(yīng)地改變由壓電陶瓷管制備的掃描器的Z軸驅(qū)動(dòng)電壓，使之上下運(yùn)動(dòng)，以維持針尖和樣品原子的相互作用力恒定．在此過(guò)程中，Z軸驅(qū)動(dòng)電壓信號(hào)被轉(zhuǎn)換成形貌圖像數(shù)據(jù)，該模式一般優(yōu)先使用．

圖1 不同模式探針的光學(xué)顯微鏡成像以及探針的側(cè)面圖

圖2 原子力顯微鏡基本結(jié)構(gòu)示意圖

2．2 操作模式

原子力顯微鏡與樣品間的相互作用以范德華力為主，其作用勢(shì)能一般用Lennard－Jones勢(shì)能函數(shù)表示：，式中r是兩原子的核間距，σ是勢(shì)能為0時(shí)原子核間距，ε是勢(shì)阱深度，是勢(shì)能曲線上最低點(diǎn)勢(shì)能的絕對(duì)值．當(dāng)懸臂尖端的原子與樣品靠近，開(kāi)始時(shí)吸引力起主導(dǎo)作用，隨著距離的減小，二者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡，當(dāng)兩原子進(jìn)一步靠近時(shí)，范德華力以斥力為主（圖3）．根據(jù)使用的力的性質(zhì)，可以使儀器具有不同的操作模式．接觸模式利用的是針尖與樣品之間的排斥性質(zhì)范德華力，用于研究柔軟的生物樣品時(shí)由于接觸可能使之受到破壞并污染探針產(chǎn)生假象，因此并不是用于生物樣品掃描的理想模式．非接觸模式利用的是針尖與樣品之間的吸引性質(zhì)范德華力，由于針尖與樣品的間距較大，樣品的掃描分辨率較低．輕敲模式是介于接觸模式和非接觸模式之間的一種掃描模式．該模式下針尖與樣品之間周期性地間歇接觸，好比針尖不斷地敲擊樣品．與非接觸模式的工作原理類似，是使懸臂振動(dòng)，其振幅比非接觸模式更大，因而能間歇地與樣品接觸．與非接觸模式相比，其分辨率更高；與接觸模式相比，其克服了因針尖劃過(guò)樣品而受到的摩擦力、黏附力、靜電力等的影響，并有效地避免了樣品損壞，對(duì)于研究比較軟的樣品如生物大分子而言十分有利．

圖3 Lennard－Jones勢(shì)能函數(shù)示意圖

3 儀器裝置

所用原子力顯微鏡型號(hào)為SPM－9600（島津公司），輕敲模式探針購(gòu)買自Nanoworld，懸臂彈性系數(shù)42 N／m，共振頻率320 k Hz．樣品在室溫下以輕敲模式在空氣中成像．所有圖像采集的掃描頻率為2～3 Hz，尺寸為512像素×512像素．所有圖片都經(jīng)過(guò)平滑去噪處理以提高對(duì)比度．

4 樣品制備

云母本身是層狀結(jié)構(gòu)，表面具有原子級(jí)別的平整度，用透明膠布可以方便地解理得到干凈平整的表面．因此，本實(shí)驗(yàn)將云母切割成合適大小，用雙面膠粘在直徑約1 cm，厚約1 mm的圓形鐵片上，利用其作為襯底制備樣品．實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水．λ－DNA （48，502個(gè)堿基對(duì)）購(gòu)于NEB公司，3－氨丙基三乙氧基硅烷（3－aminopropylrtiethoxysilane，APTES）、戊二醛和組蛋白均購(gòu)于Sigma公司．在實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用TE（10 mmol／L Tris－HCl＋1 mmol／L EDTA，p H8．0）緩沖液來(lái)稀釋?duì)耍璂NA．圖4所示是基本的樣品處理流程圖，在該流程基礎(chǔ)上可以增加或稍作改變一些操作步驟以適應(yīng)樣品制備需求．由于云母表面帶負(fù)電，而DNA分子也帶負(fù)電，單純地將DNA樣品沉積到云母表面會(huì)由于靜電斥力而不能穩(wěn)定地沉積在云母表面．因而，一般對(duì)云母表面進(jìn)行了修飾或在DNA溶液中加入帶正電的離子．沉積在云母表面的DNA構(gòu)象一般是溶液中的線團(tuán)狀態(tài)在二維表面上的投影，仍然是二維蜷曲的．為方便觀察或者統(tǒng)計(jì)分析，可以在必要時(shí)將DNA拉直成像．下面具體介紹這些樣品制備方法．

圖4 樣品制備基本流程示意圖

1）Mg2＋處理DNA方法．首先將TE溶液加入MgCl2使其最終濃度為3．5 mmol／L，然后用該TE＋3．5 mmol／L MgCl2緩沖溶液稀釋原始DNA溶液至1 ng／μL．然后解理云母片得到新的1層云母面，用移液器取約10μL稀釋DNA溶液滴在表面，沉積3 min，然后用約200μL純水沖洗，氮?dú)獯蹈煞湃敫稍锲? h以上待掃描．

2）APTES處理云母表面方法．首先取1%（V／V）的APTES水溶液約30μL滴在新解理的云母表面，放置約15 min，用超純水沖洗約5 min，氮?dú)獯蹈桑缓蠓胖迷?20℃烘箱中加熱30 min（該步驟的目的是鈍化表面），冷卻后放于干燥器中待用．然后如圖4所示將1 ng／μL的DNA溶液10μL滴在云母表面，沉積3 min，接著用純水沖洗并氮?dú)獯蹈煞湃敫稍锲鳎?/p>

3）戊二醛修飾云母表面方法．首先將50μL 0．01% （V／V）戊二醛用移液器滴在APTES處理過(guò)的云母上，靜置5 min，然后用純水沖洗5 min，氮?dú)獯蹈桑酉聛?lái)在該修飾云母上沉積DNA的步驟與圖4所示基本流程相同．

4）DNA拉直方法．首先將約10μL稀釋DNA溶液或DNA－組蛋白復(fù)合物溶液滴在APTES處理過(guò)的云母片上（由于APTES的疏水作用，小液滴呈現(xiàn)小珠狀），樣品沉積在云母表面約5 min，用鑷子夾著云母片與桌面成45°，氮?dú)鈴囊旱紊戏脚c云母成較小角度吹液滴，使其慢慢脫離云母表面．然后用移液器滴約20μL純水在云母上，用移液器槍嘴稍微接觸液滴的邊緣，按照第一步中液滴移動(dòng)的方向慢慢吸走樣品，如此重復(fù)20次左右，氮?dú)獯蹈?，干燥?/p>

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

圖5（a）為利用Mg2＋處理方法掃描得到的λ－DNA形貌，可以看到DNA處于自然蜷曲線團(tuán)狀態(tài)，分布均勻，圖像清晰，效果較好．APTES是一種硅烷化試劑，修飾在云母表面后其末端氨基能夠固定DNA片段，因此與Mg2＋處理方法相比具有不易受操作因素而影響沉積DNA構(gòu)象的優(yōu)點(diǎn)．圖5（b）是在APTES處理的云母基底上利用拉直技術(shù)成像的DNA－組蛋白復(fù)合物形貌，可以看到DNA的拉直效果很好，并且DNA與組蛋白結(jié)合之后成串珠狀形貌，與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)類似．由于組蛋白帶正電，如果組蛋白濃度過(guò)高，其正電荷會(huì)完全中和所結(jié)合的DNA所帶負(fù)電荷，甚至復(fù)合物本身帶上正電，從而與APTES處理的帶正電云母基底相排斥，造成復(fù)合物不能穩(wěn)定地沉積，導(dǎo)致掃描成像不能觀察到復(fù)合物．因此，利用戊二醛處理云母表面方法沉積帶正電的生物大分子復(fù)合物．圖5（c）即為利用該方法得到的高組蛋白濃度下的DNA－組蛋白復(fù)合物（組蛋白濃度為60 nmol／L，DNA濃度為1．5 ng／μL）形貌，可以看到復(fù)合物仍然能結(jié)合在云母上良好成像．該方法的原理是利用戊二醛的蛋白質(zhì)偶聯(lián)作用結(jié)合上組蛋白分子并將之固定在襯底上，即使經(jīng)過(guò)沖洗和氮?dú)飧稍锊襟E也能得到穩(wěn)定的沉積物．

掃描成像的效果還受操作因素的影響．具體來(lái)說(shuō)，Mg2＋處理方法中如果Mg2＋濃度過(guò)高或者沖洗不充分，過(guò)多的Mg2＋會(huì)通過(guò)離子橋連作用造成DNA分子之間的交聯(lián)，掃描時(shí)得到不理想的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)．圖5（d）是 Mg2＋濃度為5 mmol／L時(shí)由于沖洗不充分，有過(guò)多的Mg2＋參與DNA分子之間的交聯(lián)而造成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)．而如果沖洗步驟中移液器吸取溶液速度過(guò)快造成負(fù)壓過(guò)高，可能會(huì)將已沉積上的大分子吸入或者改變其沉積形貌，很難觀察到沉積的大分子或者非正常的形貌．此外，氮?dú)飧稍飼r(shí)如果氮?dú)饬魉龠^(guò)高，可能造成同樣的后果．因此，為提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，需要控制吸取速度和氮?dú)饬魉偈怪m中．一般在云母片邊緣以低于3μL／s的速度吸取溶液，干燥時(shí)氮?dú)饬魉倏刂圃趧偤媚艽底弑砻嬉旱蔚乃俣龋?/p>

圖5 λ－DNA及DNA－組蛋白復(fù)合物圖像

6 結(jié)束語(yǔ)

本文介紹了利用AFM成像DNA大分子以及DNA－組蛋白質(zhì)復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)方法．該方法不僅可用于科學(xué)研究，還可引入近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)．該實(shí)驗(yàn)的開(kāi)設(shè)可提高學(xué)生的動(dòng)手操作能力，并對(duì)生物學(xué)中重要的大分子如DNA分子進(jìn)行直接觀察，拓寬學(xué)生們對(duì)生物學(xué)與物理學(xué)結(jié)合領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)．

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