曾岳岳， 黃正接， 羅 琪

2006年日本京都大學(xué)的Takahashi等［1］首次報道，將選擇的特定外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠的成纖維細胞，可以成功誘導(dǎo)出多能性的類胚胎干細胞，他們把這類細胞命名為——誘導(dǎo)多能干細胞(iPS cell)。這一新的突破在理論上首次證實了已分化成熟的體細胞同樣可以被重編程而轉(zhuǎn)化為類胚胎干細胞，且成功地解決了難以突破的倫理及免疫排斥問題，為再生醫(yī)學(xué)增加了一個新途徑。運用此重編程技術(shù)能從特定疾病的患者體內(nèi)提取成體細胞，進而誘導(dǎo)成疾病特異iPS細胞。疾病特異iPS細胞的誘導(dǎo)成功更為體外研究遺傳疾病發(fā)生、發(fā)展和組織形成提供了更加廣泛和大量的研究模型，并將有力推動基因治療和藥物研發(fā)。但是，重編程外源基因組及使用病毒載體會影響iPS細胞基因組，即可能引發(fā)潛在的插入性腫瘤和干擾誘導(dǎo)多能干細胞分化。因此，尋找合適的載體是誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)的重要研究課題。載體是由質(zhì)粒、噬菌體及病毒衍生而來的，具有攜帶功能的DNA分子，在載體中可插入外源基因片斷，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或利用病毒進入細胞的機制導(dǎo)入到一個宿主細胞中，并在其中進行復(fù)制或表達。

1 使用病毒載體誘導(dǎo)iPS細胞

1.1 以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體 2007年Okita 等［2］報道，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將 Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4種因子導(dǎo)入人類成纖維細胞，成功誘導(dǎo)成類胚胎干細胞。幾乎與之同時，美國科學(xué)家Yu等［3］也成功地將人類成纖維細胞誘導(dǎo)成類胚胎干細胞。與Okita研究組所不同的是，Yu等運用的載體為慢病毒，所采用的轉(zhuǎn)錄因子是通過自篩而確定的4種因子組合，即 Oct3/4、Sox2、Nanog和 Lin28。結(jié)果顯示，生成的iPS細胞與人的類胚胎干細胞特性高度一致。隨后，研究小組將iPS細胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚層細胞的畸胎瘤，進一步證實其具有類似胚胎干細胞的發(fā)育潛能。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染體細胞誘導(dǎo)成iPS細胞的方法，因其直接使外源性基因和載體整合到受體體內(nèi)的基因組，會引起插入突變以干擾正常的iPS細胞系的功能，而細胞中殘余的外源因子序列的表達會影響分化，甚至有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的危險性。特別是原癌基因c-Myc的導(dǎo)入，由其構(gòu)建的嵌合體小鼠中約20%發(fā)生了腫瘤［3］。因此，目前很多學(xué)者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體誘導(dǎo)iPS細胞的臨床應(yīng)用也受到了極大的限制。

1.2 以腺病毒為載體 2008年 Stadtfeld等［4］報道，使用腺病毒載體(adenoviral vectors)轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4種因子，成功地將小鼠肝細胞改造成iPS細胞。研究者使用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和 Southern blotting等方法未發(fā)現(xiàn)腺病毒載體基因組及轉(zhuǎn)導(dǎo)因子基因組整合到宿主細胞基因組中的跡象。與逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒相比，腺病毒載體可以使外源基因組不會整合到宿主細胞基因組當(dāng)中，解決了外源基因組對iPS細胞分化干擾的難題。然而，以腺病毒為載體誘導(dǎo)iPS 細胞的效率非常低(0.000 1% ～0.001 8%)，比逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的誘導(dǎo)率(0.1%)低很多，這就限制了其臨床應(yīng)用。

2 使用質(zhì)粒載體誘導(dǎo)iPS細胞

2.1 以質(zhì)粒為載體 2008年日本學(xué)者Okita等［5］使用質(zhì)粒(plasmid)為載體，攜帶轉(zhuǎn)染所需的因子基因，成功地將小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)成類胚胎干細胞——iPS細胞。這種方法不僅防止了病毒載體基因組整合到宿主細胞基因組中，同時可以防止外源基因干擾iPS細胞的分化。Okita等利用質(zhì)粒的自我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等特性，設(shè)計了兩種攜帶轉(zhuǎn)染因子的質(zhì)粒改造小鼠成纖維細胞，一種為pCX-OKS-2A，其由一段2A肽(來自口蹄疫病毒，具有自我清除作用)攜帶Oct4、Sox2和Klf4 3種轉(zhuǎn)導(dǎo)基因;另一種是pCX-c-Myc，由一段2A肽攜帶c-Myc轉(zhuǎn)染基因。兩種質(zhì)粒經(jīng)多次瞬間轉(zhuǎn)染，將小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)成iPS細胞。此法大大消除了插入性腫瘤形成的風(fēng)險及再激活癌基因的可能性。但其仍然無法突破一個障礙——iPS細胞誘導(dǎo)率極低。采用此法轉(zhuǎn)導(dǎo)1×106個成體細胞只成功改造了1～29個iPS細胞，而在同樣的實驗條件下，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體卻能成功轉(zhuǎn)染1～1 000個iPS細胞［6］。西班牙學(xué)者Gonzalez等［7］改進了Okita研究組的方法，他們采用一個質(zhì)粒載體就將小鼠胚胎成纖維細胞成功地誘導(dǎo)出iPS細胞。并設(shè)計出一個含Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的多順反子質(zhì)粒載體pCAG-OSKM，通過瞬間轉(zhuǎn)染的方法改造小鼠胚胎成纖維細胞成iPS細胞。但誘導(dǎo)率仍很低。

2.2 以oriP/EBNA1質(zhì)粒為載體 Yu等［8］于2009年利用oriP/EBNA1質(zhì)粒，首次生成無外源基因重編程的人iPS細胞。EBNA1和oriP是EB病毒(epstein-barr virus，EBV)中與復(fù)制和保持病毒基因組游離性的重要基因元件。具有oriP/EBNA1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人靶細胞后不整合，并可長期穩(wěn)定存在，不會造成宿主細胞的突變。同時，由于其具有增強轉(zhuǎn)錄及免疫逃逸等功能，使質(zhì)粒攜帶的目的基因能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率［9］。Yu工作小組經(jīng)研究得出，當(dāng)oriP/EBNA1質(zhì)粒只整合 Oct4、Sox2、Nanog及 Lin28 4種外源基因，其改造人新生兒包皮成纖維細胞的成功率為0.1%，但當(dāng)再增加c-Myc和Klf4轉(zhuǎn)導(dǎo)基因后，其誘導(dǎo)成功率則增加10倍。

3 使用酶切系統(tǒng)誘導(dǎo)iPS細胞

3.1 利用 Cre/LoxP重組系統(tǒng) Soldner等［10］從帕金森病患者身上提取成纖維細胞和利用強力霉素誘導(dǎo)的慢病毒載體，通過酶切Cre/LoxP重組系統(tǒng)成功地培育出不含外源基因的人iPS細胞。酶切Cre/LoxP系統(tǒng)可以使某一基因在特定的組織、細胞中，在細胞分化，成熟過程的某一時段被剔除，以減輕其帶來的副作用。這雖能除去外源因子序列，但載體序列仍會有殘留，因此仍可能造成插入性突變。此外采用這種方法誘導(dǎo)的成功率仍然很低，轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種基因后，其誘導(dǎo)成功率只有0.01%［11］。

3.2 利用piggyBac轉(zhuǎn)座子 Yusa等［12］報道，利用piggyBac轉(zhuǎn)座子方法，將小鼠胚胎成纖維細胞成功地改造成iPS細胞。piggyBac是一種從粉紋夜蛾(trichoplusia ni.)中分離到的、具有TTAA插入位點特異性的DNA轉(zhuǎn)座子。piggyBac可在昆蟲基因組中準確切離，轉(zhuǎn)化頻率較高，且不受宿主因子的限制［13］。Yusa研究小組設(shè)計了含有piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、具有自我清除作用的F2A肽及T2A肽的載體，轉(zhuǎn)染 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc基因。此載體能通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)形成的轉(zhuǎn)座酶及F2A肽和T2A肽切除插入的外源基因和載體序列，因此，得到的iPS細胞不會留下外源基因組的“足跡”［14］，可更好地應(yīng)用于臨床。更重要的是利用piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和 Lin28 5 種基因能使轉(zhuǎn)導(dǎo)率達到1%，相當(dāng)于以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)率［15］。

4 使用重組蛋白誘導(dǎo)iPS細胞

2009年 Zhou 等［16］將重組蛋白(Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R)轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細胞，成功地誘導(dǎo)出類胚胎干細胞——蛋白誘導(dǎo)多能干細胞(piPSC)。這一技術(shù)在誘導(dǎo)iPS細胞領(lǐng)域里產(chǎn)生了重大的突破，能在不涉及基因組調(diào)節(jié)的情況下，只憑借蛋白質(zhì)就能將小鼠胚胎成纖維細胞誘導(dǎo)成iPS細胞，這一技術(shù)大大簡化了將細胞重編程為類胚胎干細胞的常用技術(shù)的繁瑣步驟。Zhou的研究小組首先將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種基因重編程大腸桿菌細胞，促使大腸桿菌表達4種基因，形成的蛋白經(jīng)過正確折疊、修飾、純化和連接目標肽，在目標肽的引導(dǎo)下通過滲透法進入小鼠胚胎成纖維細胞，發(fā)揮誘導(dǎo)功能。實驗證實只有通過反復(fù)多次的轉(zhuǎn)入重組蛋白，才可能誘導(dǎo)出類胚胎干細胞。這種方法與之前誘導(dǎo)多功能干細胞的方法相比有以下2點優(yōu)勢［17］:(1)有效地消除了外源基因和序列對細胞基因的修改造成的風(fēng)險;(2)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法更加簡單快速、經(jīng)濟實用。然而，缺點就是難以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在轉(zhuǎn)導(dǎo)4種重組蛋白及組蛋白脫乙酰化酶抑制劑——丙戊酸(valproic acid，VPA)(也能提高Oct4、Sox2、和Klf4 3種基因誘導(dǎo)的成纖維細胞重編程效率［18］)的作用下，僅能將5×104個小鼠胚胎成纖維細胞成功改造得到3個iPS細胞。

5 結(jié)語

iPS細胞研究在短短幾年時間里已取得重大的突破，為避免重編程外源基因可能導(dǎo)致受體發(fā)生插入性腫瘤及影響細胞分化等潛在性危險，應(yīng)盡量減少外源基因的整合。從2006年 Takahashi等轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc等24種因子到如今 Kim等［19］只轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4一個基因就誘導(dǎo)得到iPS細胞，可見其研究進展是迅速的。科學(xué)家首次誘導(dǎo)iPS細胞使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒，出現(xiàn)了載體的序列整合到宿主細胞基因組，存在癌基因激活的危險。因此，研究者又陸續(xù)研發(fā)了慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒載體，重組蛋白轉(zhuǎn)染成體細胞誘導(dǎo)得到iPS細胞，大大減少了外源基因的整合，然而科學(xué)家在設(shè)計出更安全的載體后，又普遍出現(xiàn)了誘導(dǎo)效率低下的困惑，這嚴重影響了誘導(dǎo)多能干細胞的臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)。因此，iPS細胞領(lǐng)域的研究者都期待著在不轉(zhuǎn)導(dǎo)外來基因組的情況下，通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)或?qū)ふ腋m合的誘導(dǎo)細胞和載體技術(shù)，創(chuàng)造出更安全、更高效、更穩(wěn)定的 iPS細胞。

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