田 力,曹悅鞍

迄今為止,大腸癌的發(fā)生和發(fā)展的確切機制尚未闡明,但一般認為是一個涉及多因素、多步驟、多基因改變的復雜過程,包括癌基因的激活、抑癌基因的失活,以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定等。以往的研究認為腫瘤的分期是影響腫瘤發(fā)展和預后的唯一因素。自1993年發(fā)現(xiàn)錯配修復基因缺陷與大腸癌的發(fā)病相關以來[1-2],越來越多的實驗研究證實錯配修復基因的失活在大腸癌的發(fā)生及預后中起著重要的作用。本文歸納了近年來對錯配修復基因的相關研究,闡述其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制,并探討其臨床預后、預測的意義。

1 錯配修復基因系統(tǒng)的分子基

微衛(wèi)星是分布生物基因種系中串聯(lián)的重復系列,包含單核苷酸、雙核苷酸或多核苷酸重復序列,如(A)n或(CA)n。這些重復序列突變易積累,主要是因為DNA聚合酶在DNA合成過程中不能將DNA雙鏈有效正確配對起來。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)最常見的錯誤是堿基錯誤配對,逃脫了DNA聚合酶、插入-缺失回路的本身固有的校對功能。腫瘤的MSI是指與正常細胞相比,腫瘤細胞中某一微衛(wèi)星長度發(fā)生改變,也稱“復制錯誤”表型或“普遍性體細胞突變”。所謂“普遍性體細胞突變”是指在人體細胞基因組中普遍存在的被稱為微衛(wèi)星的簡單重復序列拷貝數(shù)的改變。MSI分為3類,①高頻MSI(MSI-H):2個或多個微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定(或檢測的大板標記中大于30%的位點不穩(wěn)定);②低頻MSI:只有1個微衛(wèi)星位點不穩(wěn)定(10%～30%標記位點不穩(wěn)定);③微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability,MSS):也稱為無不穩(wěn)定微衛(wèi)星位點(小于10%標記點不穩(wěn)定)。MSI的發(fā)生與錯配修復基因系統(tǒng)缺失密切相關。MSI-H通常稱為DMMR,MSI、MSS稱為PMMR。

錯配修復基因系統(tǒng)(mismatch repaire,MMR)是機體內DNA修復機制的一種形式,廣泛存在于生物體內,在防止基因突變、維持基因組穩(wěn)定性和DNA復制高保真的過程中起關鍵作用,具有對微衛(wèi)星監(jiān)測及對其錯誤的更正修復功能。人類錯配修復系統(tǒng)是人體細胞中存在的一種能修復DNA堿基錯配的安全保障系統(tǒng),它由一系列能特異性識別、雙向切除并修復錯配堿基的酶分子組成,對保持遺傳物質的穩(wěn)定性和完整性、避免遺傳突變的產生具有重要作用。MMR系統(tǒng)主要包含以下幾種蛋白:MLH 1、MSH2 、MSH 3、MSH6 和 PMS2,它們之間相互連接形成異源二聚體。MSH 2分別與MSH6、MSH 3配對形成 MutSα復合物和 MutSβ。MutSα可識別單個堿基錯配,MutSβ可識別2～4個堿基甚至更多的插入或缺失錯配[3]。MLH 1則分別與 PMS2、PMS1和 MLH3 形成 MutLα、MutLβ 和MutLγ復合物。這些蛋白復合物一旦檢測到堿基錯配,就能與有關的酶配合,切除含有錯配的DNA片段,并合成新的DNA片段以代替被切除的部分,進而完成錯配DNA鏈的修復過程。MMR缺失會導致DNA鏈錯配的積聚,從而導致MSI。

2 MSI與大腸癌

2.1 MSI引起結直腸癌的分子機制 MSI引發(fā)的特殊基因和信號轉導途徑突變,是導致大腸癌的機制之一。錯配修復基因缺失(deficient mismatch repair,dMMR)引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定,微衛(wèi)星重復序列中30多個基因突變,如DNA修復蛋白MRE11A、hRAD50、轉化生長 因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)受體 Ⅱ、胰島素樣生長因子(insulin-like grow th factor,IGF)受體Ⅱ、前凋亡因子Bax、錯配修復蛋白MSH3和 MSH6等[4]。這些基因在細胞功能及轉導途徑中發(fā)揮多種作用,其突變的急速積聚可誘發(fā)大腸癌的發(fā)生。

BRAF基因突變已被證實在大腸癌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,BRAF15外顯子基因編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶,在促分裂原活化蛋白激酶信號通路(RAS/RAF/MEK/MAP)起重要作用,而 RAS/RAF/MEK/MAP激酶途徑在胞內信號轉導途徑中有重要作用,調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡。BRAF突變可導致促調亡蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的抑制而抑制細胞凋亡,促進結直腸腫瘤的發(fā)展[5]。BRAF磷酸化在人類腫瘤中能激活促分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein,MAP)/細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signalregulating kinase,ERK)1/2,并磷酸化 ERK1/2,激活MAPK(促分裂原活化蛋白激酶),即激活了RAF-促分裂原活化蛋白激酶信號通路(RAF-MEKERK1/2);ERK1/2被激活后,使Bim磷酸化,阻止其綁定到Bcl-2目標上,從而抑制細胞凋亡[6]。

BRAF突變在散發(fā)的hMLH1甲基化的結直腸癌中普遍存在,已有研究表明BRAF突變與DNA錯配修復缺乏導致的hMLH 1甲基化相關。例如有實驗證實87%的有hMLH1甲基化的結直腸癌細胞系中存在BRAF突變,而僅4%的hMLH1未甲基化的細胞系中存在 BRAF突變[7-8]。Domingo等[9]研究顯示,BRAF V600E突變在散發(fā)性MSI-H腫瘤中占40%(82/206),但是在111例遺傳性非息肉性結直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)中未檢測出該突變。另一實驗研究顯示,任何 HNPCC患者中均未檢測到 BRAF V600E突變[10]。結果顯示,BRAF突變經常出現(xiàn)在hMLH 1甲基化散發(fā)性結直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者中,但是不會出現(xiàn)在HNPCC相關的腫瘤患者中。這種BRAF突變的差異可能會用于鑒別散發(fā)的 MSI-H CRC患者和 HNPCC患者。Nagasaka等[7]檢測了11個位點的啟動子的甲基化狀態(tài)與BRAF突變的相關性,發(fā)現(xiàn)BRAF突變與平均7.2個(95%,CI:6.6～7.9)位點甲基化相關。而在散發(fā)性大腸癌中,hMLH1甲基化是導致MSI的主要因素。很多實驗證實,BRAF突變與MSI高度相關[8,11-12]。有報道BRAF突變僅在MSI-H腫瘤中存在,而KRAS突變在MSI-L或MSS腫瘤中可被檢測出[13]。故可以推測,散發(fā)性CRC的MSI腫瘤發(fā)展可能經由BRAF途徑,但相關機制至今沒有被詳細闡述。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)是腫瘤形成的啟動子之一,PIK3CA在PI3K通路中發(fā)揮關鍵作用,在 30%CRC患者中發(fā)生PIK3C突變[14]。MSI腫瘤PIK3CA突變多于MSS腫瘤[14-15]。MSI腫瘤可能也經由PI3K/ATK/mTOR(磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)信號通路。

BRAF突變,KRAS突變、CpG島甲基化、PIK3C突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性都在結直腸腫瘤中被高頻檢測到。近年來研究熱點包括四者之間是否存在相關性,以及它們之間的相互作用、導致結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的機制。

2.2 遺傳性非息肉性結直腸癌與散發(fā)性結直腸癌MSI的發(fā)生機制 遺傳性非息肉性結直腸癌與散發(fā)性結直腸癌dMMR發(fā)生機制不同。MLH 1、MSH 2、MSH 6和 PMS2等基因系突變易導致HNPCC的發(fā)生[16]?；虮硇褪?HNPCC的診斷金標準。79%～93%HNPCC為 MSI表型。MSI作為HNPCC的基因標志物作用已在臨床中得到認可。由MMR基因變異引起的HNPCC MSI陽性病例隨年齡增長逐漸下降,大于 50歲患者只有17%。MMR基因突變引起男性大腸癌發(fā)生率為60%～70%,女性則為30%～40%[17-18]。HNPCC是常染色體顯性遺傳疾病,占結直腸癌總發(fā)病率的2%～3%[19]。其特征是發(fā)病年齡輕,多小于50歲,有家族史,以右半結腸癌為主,常伴有同時和異時結腸原發(fā)癌及結腸外腫瘤,組織病理學符合 Lynch syndrome(印戒細胞、生長緩慢、類克隆病反應、黏蛋白含量＞50%、腫瘤淋巴細胞浸潤)。該類患者預后較好,5年生存期大于散發(fā)結直腸癌患者。

在MSI-H散發(fā)性結直腸癌中,通常發(fā)病年齡超過70歲,主要是MLH 1的CpG島高甲基化表型致d MMR引起,腫瘤抑制基因轉錄沉默[8]。MLH 1沉默占MSI-H病例的 95%,MSH 2、MSH6分別占MSI-H的 5%和不足1%[20]。與 MSI-L、MSS相比,MSI-H病例有顯著特點,即發(fā)病年齡相對年輕、分化高、發(fā)病部位為近段結腸、分期早、不易轉移,且預后較好[21]。

3 MSI在結直腸癌預后及治療中的作用

一些臨床研究表明,CRC中MSI發(fā)生率波動于8%～20%,這與腫瘤分期相關。Ⅱ期患者MSI發(fā)生率最高為20%,Ⅲ期為12%,Ⅳ期發(fā)生率最低為4%[19,22]。其原因還未明確。

MSI表型主要有3個臨床用途,即:CRC預后;預測對化療藥物的反應,如氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康等;對HNPCC的基因評估。MSI CRC預后相對MSS更好,不易發(fā)生淋巴結轉移和遠處轉移。這個結論被隨后的臨床研究所證實[23]。對32個臨床研究數(shù)據(jù)進行meta分析,共包含了7 642例CRC病例,其中1 277病例表型為MSI,分析結果顯示出MSI腫瘤患者預后良好優(yōu)勢[22]。提示MSI在CRC中預后價值的優(yōu)越性。2009年美國臨床腫瘤學會(ASCO)年度會議上提出MSI在Ⅱ期CRC預后價值較Ⅲ期更顯著[24]。

MSI作為5-FU、伊立替康等化療藥物敏感性的預測分子標志物,目前還有爭論[25-26]。Sargent等[27]回顧性研究包含5個臨床中心的隨機對照研究5-FU為基礎的輔助化療方案對Ⅱ期、Ⅲ期CRC患者的療效,使用奧沙利鉑、伊立替康、口服氟尿嘧啶等藥物患者被排除在研究范圍外。結果證實,dMMR在Ⅱ期CRC發(fā)生頻率更高,行5-FU為基礎的化療方案對PMM R和Ⅲ期dMMR CRC患者有效,可提高其無病生存期(isease-free surial,DFs)。但對于dMMRⅡ期CRC患者,化療不僅沒有療效優(yōu)勢,甚至于對MSI CRC患者有危害,可顯著減低其DFA和總生存期。

伊立替康是拓撲異構酶Ⅰ抑制劑。拓撲異構酶Ⅰ可引起DNA鏈在復制和轉錄過程中出現(xiàn)暫時缺口。伊立替康可結合到DNA-拓撲異構酶Ⅰ復合物上,阻礙DNA再連接,導致DNA雙鏈分解。如果DNA修復系統(tǒng)不能發(fā)揮作用,最終導致細胞的凋亡。微衛(wèi)星MRE11A、hRAD50突變會引起DNA修復功能障礙,理論上可能對伊立替康有效。有4個臨床研究分析伊立替康對 MSI CRC的治療作用。其中,第1個研究示單中心72例CRC轉移患者按微衛(wèi)星狀態(tài)分類,接受伊立替康治療的臨床試驗[28]。第2個研究是美國腫瘤與血液病學研究組(GALGB)治療方案前瞻性研究702例Ⅲ期CRC患者,比較5-FU聯(lián)合伊立替康與單藥5-FU輔助化療療效比較[29],數(shù)據(jù)顯示MSI-H聯(lián)合方案治療組有5年無病生存期優(yōu)勢,但無顯著性優(yōu)勢。MSS腫瘤患者未顯示出聯(lián)合化療的優(yōu)勢。在2009 ASCO年會上提供的研究數(shù)據(jù)未證實前者結論。在這個研究中,回顧性分析了一項隨機試驗PETACC-3試驗中1 254例Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者,其中188例MSI-H患者伊立替康治療后生存期無改善。Meta分析也未得到Ⅳ期MSI CRC患者接收伊立替康為基礎的化療方案的有效性[28,30]。因此,還需更多的臨床研究來證實伊立替康對MSI腫瘤的治療作用。

基于上述的研究,2011年結直腸癌的美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南提出,對小于50歲的CRC患者,應該考慮行MMR基因檢測。Ⅱ期MSI-H CRC患者預后好,但5-FU輔助化療不能使其受益。

許多研究結果證實,MSI是大腸癌的發(fā)病機制之一。MSI腫瘤信號通路的研究對其治療策略提供了新思路。例如。微衛(wèi)星MRE11A、hRAD50突變會引發(fā)DNA雙鏈分解修復系統(tǒng)缺失,體外細胞實驗證實PARP-1抑制劑可抑制MSI細胞系的生長和MRE11A的表達水平,有可能成為治療MSI腫瘤的有效靶向劑。由于連接圖譜生物技術的應用,LY-294002和西羅莫司(PI3K/ATK/mTOR信號通路靶向劑)會引起基因表達改變,從而抑制MSI腫瘤的表達[31]。這個發(fā)現(xiàn)也進一步明確了MSI腫瘤的PI3K/ATK/mTOR信號通路,并幫助研發(fā)新的靶向治療劑。

隨著分子生物實驗技術的提高,MMR的基因檢測相對簡單、方便,準確率高。MMR在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,是大腸癌預后及療效預測的分子標志之一。但仍需更多的大宗臨床試驗及數(shù)據(jù)來完善MSI在CRC中的作用。尤其在中國,尚未有臨床試驗進行此研究。不同的MMR基因在不同類型的CRC中發(fā)揮的作用不同,具體作用機制仍需進一步研究予以闡明,是否存在其他的錯配修復基因及其潛在作用需要進一步探索。dMMR的遺傳標記的明確和快速準確的檢測方法也需要進一步研究。這些研究的進一步深入會對大腸癌的預防、早期診斷及治療提供更大的幫助。

[1]Aaltonen LA,Peltom?ki P,Leach FS,et al.Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer[J].Science,1993,260(5109):812-816.

[2]Ionov Y,Peinado MA,Malkhosyan S,et al.Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis[J].Nature,1993,363(6429):558-561.

[3]Dunlop MG,Farrington SM,Nicholl I,et al.Population carrier frequency of hMSH2 and hMLH1 mutations[J].Br J Cancer,2000,83(12):1643-1645.

[4]Duval A,Hamelin R.Mutations at coding repeat sequences in mismatch repair-deficient human cancers:toward a new concept of target genes for instability[J].Cancer Res,2002,62(9):2447-2454.

[5]Symvoulakis EK,Zaravinos A,Panutsopulos D,et al.Highly conserved sequence of exon 15 BRAF geneand KRAS codon 12 mutation among Greek patients with colorectal cancer[J].Int J Biol Markers,2007,22(1):12-18.

[6]Wickenden JA,Jin H,Johnson M,et al.Colorectal cancer cells with the BRAF(V600E)mutation are addicted to the ERK 1/2 pathway for growth factor-independent survival and repression of BIM[J].Oncogene,2008,27(57):7150-61.

[7]Nagasaka T,Sasamoto H,Notohara K,et al.Colorectal cancer with mutation in BRAF,KRAS,and wild-type with respect to both oncogenes showing different patterns of DNA methylation[J].J Clin Oncol,2004,22(22):4584-4594.

[8]Brim H,Mokarram P,Naghibalhossaini F,et al.Impact of BRAF,MLH 1 on the incidence of microsatellite instability high colorectal cancer in populations based study[J].Mol Cancer,2008,7:68.

[9]Domingo E,Laiho P,Ollikainen M,et al.BRAF screening as a low-cost effective strategy for simplifying HNPCC genetic testing[J].JMed Genet,2004,41(9):664-668.

[10]Bettstetter M,Dechant S,Ruemmele P,et al.Distinction of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and sporadic microsatellite-unstable colorectal cancer through quantification of MLH1 methylation by realtime PCR[J].Clin Cancer Res,2007,13(11):3221-3228.

[11]Ang PW,Li WQ,Soong R.BRAF mutation is associated with the CpG island methylator phenotype in colorectal cancer f rom young patients[J].Cancer Lett,2009,273(2):221-224.

[12]Tanaka H,Deng G,Matsuzaki K,et al.BRAF mutation,CpG island methylator phenotypeand microsatellite instability occur more frequently and concordantly in mucinous than non-mucinous colorectal cancer[J].Int JCancer,2006,118(11):2765-2771.

[13]Kumar K,Brim H,Giardiello F,et al.Distinct BRAF(V600E)and KRAS mutations in high microsatellite instability sporadic colorectal cancer in African Americans[J].Clin Cancer Res,2009,15(4):1155-61.

[14]Samuels Y,Wang Z,Bardelli A,et al.High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers[J].Science,2004,304(5670):554.

[15]Abubaker J,Bavi P,Al-Harbi S,Ibrahim M,et al.Clinicopathological analysis of colorectal cancers with PIK 3CA mutations in Middle Eastern population[J].Oncogene,2008,27(25):3539-3345.

[16]Hendriks YM,de Jong AE,Morreau H,et al.Diagnostic approach and management of Lynch syndrome(hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma):a guidefor clinicians[J].CA Cancer JClin,2006,56(4):213-225.

[17]Pi?ol V,Castells A,Andreu M,et al.Accuracy of revised Bethesda guidelines,microsatellite instability,and immunohistochemistry for the identification of patients with hereditary nonpolyposis colorectal cancer[J].JAMA,2005,293(16):1986-1994.

[18]Chen S,Wang W,Lee S,et al.Prediction of germline mutations and cancer risk in the Lynch syndrome[J].JAMA,2006,296(12):1479-1487.

[19]Hampel H,Frankel WL,Martin E,et al.Screening for the Lynch syndrome(hereditary nonpolyposis colorectal cancer)[J].N Engl J Med,2005,352(18):1851-1860.

[20]Cunningham JM,Kim CY,Christensen ER,et al.The frequency of hereditary defective mismatch repair in a prospective series of unselected colorectal carcinomas[J].Am J Hum Genet,2001,69(4):780-790.

[21]Popat S,Hubner R,Houlston RS.Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis[J].JClin Oncol,2005,23(3):609-618.

[22]Koopman M,Kortman GA,Mekenkamp L,et al.Deficient mismatch repair system in patients with sporadic advanced colorectal cancer[J].Br J Cancer,2009,100(2):266-273.

[23]Watanabe T,Wu TT,Catalano PJ,et al.Molecular predictors of survival after adjuvant chemotherapy for colon cancer[J].N Engl J Med,2001,344(16):1196-1206.

[24]Vilar E,Gruber SB.Microsatellite instability in colorectal cancer-the stable evidence[J].Nat Rev Clin Oncol,2010,7(3):153-162.

[25]Jover R,Zapater P,Castells A,et al.Mismatch repair status in the prediction of benefit from adjuvant fluorouracil chemotherapy in colorectal cancer[J].Gut,2006,55(6):848-855.

[26]Des Guetz G,Schischmanoff O,Nicolas P,et al.Does microsatellite instability predict theefficacy of adjuvant chemotherapy in colorectal cancer?A systematic review with meta-analysis[J].Eur J Cancer,2009,45(10):1890-1896.

[27]Sargent DJ,Marsoni S,Monges G,et al.Defective mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer[J].J Cliu Oncol,2010,28(20):3219-3226.

[28]Fallik D,Borrini F,Boige V,et al.Microsatellite instability is a predictive factor of the tumor response to irinotecan in patients with advanced colorectal cancer[J].Cancer Res,2003,63(18):5738-5744.

[29]Deng G,Bell I,Crawley S,et al.BRAF mutation is frequently present in sporadic colorectal cancer with methylated hMLH1,but not in hereditary nonpolyposis colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10(1 Pt 1):191-195.

[30]Koopman M,Antonini NF,Douma J,et al.Sequential versus combination chemotherapy with capecitabine,irinotecan,and oxaliplatin in advanced colorectal cancer(CAIRO):a phaseⅢrandomised controlled trial[J].Lancet,2007,370(9582):135-142.

[31]Vilar E,Mukherjee B,Kuick R,et al.Gene expression patterns in mismatch repair-deficient colorectal cancers highlight the potential therapeutic role of inhibitors of the phosphatidylinositol 3-kinase-AKT-mammalian target of rapamycin pathway[J].Clin Cancer Res,2009,15(8):2829-2839.