劉穎 程朱

(1.長春醫(yī)學高等專科學校 長春 130031; 2.長春市兒童醫(yī)院 長春 130021)

近年來,對腫瘤細胞死亡的研究越來越引起重視,用AS2O3治療急性白血病已有了突破的進展,其治療機制是誘導腫瘤細胞凋亡主要表現(xiàn)在細胞核超微結構改變。最近我們發(fā)現(xiàn)AS2O3重點在線粒體的形態(tài)改變及bcl-2、bax的表達,以闡明AS2O3引起胃癌凋亡的作用點,并證實AS2O3是一種線粒體毒性藥物。

1 材料與方法

1.1 細胞和用藥方法

細胞為北京腫瘤研究所人胃癌細胞株,將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板,內置蓋玻片,每孔接種細胞5×104個,分1、23umol/L濃度AS2O3及1組對照組,在第2,4,6,12,24h取標本檢查。

1.2 透射電鏡檢查

收獲細胞離心團,2.5%戊二醛固定,常規(guī)電鏡制樣,日立H-300電鏡檢查。

1.3 流式細胞儀檢查

DNA倍體測定按常規(guī)制樣,碘化丙錠染色,檢查細胞周期和凋亡峰。Annexin-v檢測,取培養(yǎng)細胞106用PBS洗,離心。Annexin-v-fluos標記試劑盒購自Boehringer Mannheim公司,按試劑盒方法作活細胞染色,流式細胞儀檢測。

1.4 羅達明123(Rhodamin123)熒光探針標記

Rho123,w381,MolecularProbes公司產品。細胞在24孔板蓋玻片上生長。1,2,3umol/L AS2O3作用,定時取片,Rho123(10ug/mL)染色,CO2培養(yǎng)箱溫育,在落射熒光顯微鏡下檢查,激發(fā)光505nm,發(fā)射光534nm。

1.5 免疫組織化學檢查

用細胞離心機,收集脫落細胞,4%甲醛固定。bcl-2、bax免抗人多克隆抗體及SP免疫組織化學試劑盒(Santaruz公司產品),按試劑盒操作方法。

2 結果

2.1 凋亡細胞的形態(tài)改變

培養(yǎng)細胞加不同濃度AS2O3后24h均出現(xiàn)細胞凋亡,多數(shù)細胞核染色質凝集靠邊呈典型凋亡細胞核改變。

2.2 細胞凋亡的指標

1umol/L AS2O3作用早期凋亡細胞較少,AS2O32umol/L作用4h Annexin-v顯示早期凋亡占7.1%。DNA組方圖顯示凋亡峰,12h凋亡細胞7.5%,24h凋亡細胞占35%,3umol/L AS2O3作用細胞易進入凋亡后期改變。

2.3 線粒體熒光標記

加藥2h線粒體數(shù)目增加,4h出現(xiàn)粗大線粒體,多在胞質外帶。12h及24h線粒體外形結構不清。

2.4 細胞超微結構改變

不同濃度AS2O3作用2～4h,有的線粒體腫脹,內嵴減少,有電子密度高的不定形物質沉淀,細胞核染色質開始凝集。作用6h可見線粒體嵴消失;12h外膜消失,基質呈氣球樣,并可見自噬泡。作用24h細胞皺縮,核變圓,染色質凝聚靠邊,出現(xiàn)凋亡改變。

2.5 bcl-2和bax表達

不同濃度 AS2O3作用2、6、12、24h時收集細胞,bcl-2蛋白產物免疫組織化學檢測呈陰性,bax蛋白產物免疫組織化學染色呈深褐色,為高度表達。

3 討論

細胞凋亡是一個發(fā)展的過程,有其早、中、晚期的改變,不同濃度AS2O3作用于癌細胞4～6h時出現(xiàn)凋亡早期改變;3umol/L AS2O3作用24h凋亡細胞出現(xiàn)晚期改變,多數(shù)細胞死亡,出現(xiàn)細胞皺縮,染色質凝集靠邊,核膜不完整。線粒體空泡化和外膜破裂呈氣球狀,胞質呈退行性變。線粒體是細胞進行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場所,其病變影響到細胞各成分的協(xié)調并危及細胞生命活動[1]。線粒體膜通透性改變和跨膜電位改變使線粒體腫脹,位于線粒體內外間隙的細胞色素C進入胞質,激活某些蛋白酶系統(tǒng)[2],是凋亡產生的起源。細胞核改變是核酸酶進入核內使染色質致密化和DNA斷裂。

通過我們的實驗出現(xiàn)了bcl-2表達下調和bax表達增加,證實這兩者參與了細胞凋亡的過程。bcl-2可以預防細胞凋亡,bax能促進線粒體膜通透性改變,使其細胞色素C釋放,引起細胞凋亡。我們研究證明誘導細胞凋亡,線粒體在藥物作用4h內即開始改變,也可使bcl-2和bax表達異常而產生細胞凋亡,因此認為AS2O3具有線粒體毒性作用,可用于治療胃癌。

[1]Kunz-S,chaghartLA,HabbersettRC,et al.Mitochondrial function in oncogenttransfected rat fibroblasts isolated from multicellular spheroids[J].Am Jphysiol,1997,273(5pt1):1487～1495.

[2]Basse-wetzelE,NewneyerDD,Grean DR.mitochondrial cytochrome crelease in apoposis occers upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmenbrane depolarization[J].EMBOJ,1998,17:37～49.