飼料安全與高效利用教育部工程研究中心 黎航航 陳立祥

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 蘇建明*

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是小肽吸收的載體，目前在動(dòng)物體類發(fā)現(xiàn)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至少有5種（Leibach和Ganapathy，1996），其中PepT1是研究最為廣泛的一種。近年來，編碼小肽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性蛋白質(zhì)的基因已被克隆，在小肽的吸收機(jī)制、營養(yǎng)作用和生理活性等方面取得了重大研究進(jìn)展。國外對(duì)魚類的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因研究較早，而國內(nèi)目前對(duì)PepT1的研究主要集中在哺乳動(dòng)物上，而對(duì)魚類這方面的研究還較少。在魚類中已有斑馬魚（Daniorerio，AY300011），China rockfish（Sebastesnebulosus，EU160494），大西洋鱈 魚（Gadus morhua，AY921634）和歐洲黑鱸（Dicentrarchus labrax，F(xiàn)J237043），鯉魚（Cyprinuscarpio，EU328390）等魚類的PepT1基因被克隆出來并測(cè)序分析（葉萬里和李英文，2009），并對(duì)其吸收機(jī)制作了一定的研究。

1 魚類小肽的吸收機(jī)制

1.1 魚類小肽轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生理重要性通常由兩個(gè)術(shù)語來描述，一是它們識(shí)別和結(jié)合底物分子的相對(duì)能力（即親和力）；另一個(gè)是底物通過膜被轉(zhuǎn)運(yùn)的數(shù)量和速度（即容量或速度）（孫建義等，2002）。經(jīng)許多研究證實(shí)，PepT1是低親和力/高容量的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，PepT2是高親和力/低容量的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體（Daniel，2004）。 對(duì)魚類來說，小肽的整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)過程與哺乳動(dòng)物基本相似，即：（1）通過低親和力/高容量的轉(zhuǎn)運(yùn)載體識(shí)別和結(jié)合肽；（2）通過細(xì)胞的刷狀緣膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞液，并水解為游離氨基酸；（3）通過高親和力/低容量的基底膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體把完整的肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液（Kottra等，2002）。但是魚類又有自己的特點(diǎn)，魚類PepT1最大轉(zhuǎn)運(yùn)電流存在pH依賴性，而且在刷狀緣膜上同時(shí)存在高、低兩種親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以及在基底膜上存在低親和力/高容量的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)顯示了比刷狀緣膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)更廣泛的底物結(jié)合能力（Thamotharan 等，1999）。

1.2 魚類PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)特征 Verri等（2000）通過測(cè)定脯-丙二肽D-[3H]-Phe-L-Ala的吸收和用pH敏感物染料吖啶橙監(jiān)測(cè)肽的內(nèi)胞膜酸化依賴性來對(duì)鰻鱺小腸刷狀緣膜囊泡（BBMVs）的H+/肽的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了研究，用二肽對(duì)BBMVs進(jìn)行預(yù)孵以阻止DEPC對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)的抑制，這表明，底物（二肽）能屏蔽涉及載體催化功能的組氨酸殘基。用人類PepT1特異性引物對(duì)鰻鱺小腸進(jìn)行RT-PCR信號(hào)檢測(cè)，結(jié)果表明，在鰻鱺小腸內(nèi)刷狀緣膜囊上，存在一個(gè)低親和力型的H+/肽的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，并且它的動(dòng)力學(xué)特征和哺乳動(dòng)物小腸的PepT1型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相似。Verri等（2003）又以哺乳動(dòng)物的高親和力兩性甘-谷二肽（Gly-L-Gln）為底物，利用雙電極電壓鉗技術(shù)（TEVC）來確定斑馬魚轉(zhuǎn)運(yùn)的基本動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明，在總體上，斑馬魚的PepT1與直系同源物哺乳動(dòng)物的相似，是低親和力/高容量轉(zhuǎn)運(yùn)載體。在相同的試驗(yàn)條件下，斑馬魚的轉(zhuǎn)運(yùn)過程與兔子的沒有顯著差異。TEVC試驗(yàn)中的兩個(gè)基本動(dòng)力學(xué)參數(shù)K 0.5（二肽表觀親和力）和Imax（最大轉(zhuǎn)運(yùn)電流），兔和斑馬PepT1的Gly-L-Gln的K0.5在毫摩爾計(jì)量內(nèi)是相似的。事實(shí)上，在-60 mV，pH值7.5，斑馬魚的PepT1 K 0.5是1.06 mmol/L。兔的PepT1K0.5是 0.70 mmol/L； 而在-120 mV，pH值7.5，斑馬魚的PepT1 K0.5是0.55 mmol/L，兔的PepT1 K0.5是0.42 mmol/L。然而，與高級(jí)脊椎動(dòng)物相比對(duì)方的最大轉(zhuǎn)運(yùn)活力是不依賴細(xì)胞外的pH值的。通常，Imax是依賴膜電位的，在任何pH值下，其值從-160 mV穩(wěn)定地向更低的負(fù)電位減少，然而，當(dāng)斑馬魚細(xì)胞外pH值從6.5上升至8.5時(shí)，Imax顯著增加，據(jù)了解，這是第一次發(fā)現(xiàn)這種動(dòng)力學(xué)特征類型的PepT1，在之前任何脊椎動(dòng)物PepT1蛋白中都未有過報(bào)道。因此，盡管存在這各種相似之處，但斑馬魚的PepT1與其他已知哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的動(dòng)力學(xué)行為還是存在不同，斑馬魚PepT1 Imax的pH依賴性成為其小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的獨(dú)有特征。

Sangaletti等（2009）對(duì)鱸魚的 PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行了研究，把pH依賴性的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pept1注入到非洲爪蟾屬卵母細(xì)胞中進(jìn)行電生理研究，結(jié)果表明，鱸魚PepT1在缺乏底物的情況下還是存在前穩(wěn)態(tài)電流，米氏方法分析傳輸電流顯示在酸性pH下，底物表觀親和力增加，這和斑馬魚的PepT1非常相似，但是相反的是，pH并沒有顯示出對(duì)最大轉(zhuǎn)運(yùn)電流存在顯著影響。R?nnestad等（2010）對(duì)大西洋鮭的 PepT1的分子克隆以及功能表達(dá)等方面的進(jìn)行了研究，利用TEVC技術(shù)，以兩性水解性二肽Gly-Sar作為測(cè)試底物在非洲爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)來確定鮭轉(zhuǎn)運(yùn)的基本動(dòng)力學(xué)特征。特性曲線關(guān)系的初始計(jì)量在卵母細(xì)胞內(nèi)定在-60 mV，在細(xì)胞外pH為6.5，Gly-Sar濃度分別為 0.1、0.5、10 mmol/L的條件下孵化，在pH為6.5時(shí)，內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)電流指示為負(fù)膜電位，而逆向電流卻為給多的正膜電位。而后用細(xì)胞外Gly-Sar濃度為 0.1～20 mmoL/L，pH值分別為6.5、7.5和8.5來確定K 0.5與Imax，分析顯示K 0.5與Imax對(duì)pH和膜電位都有依賴性，膜電位和pH對(duì)K0.5有很強(qiáng)的影響。而正如電轉(zhuǎn)運(yùn)預(yù)期的那樣，Imax也存在膜電位依賴性，在任何pH下，它的值也穩(wěn)定地從-160 mV向更低的負(fù)膜電位減小。而當(dāng)細(xì)胞外pH從6.5變成8.5的時(shí)候，Imax也有略微升高，這與之前報(bào)道的斑馬魚PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一致（Verri等，2010）。這也表明雖然魚與哺乳動(dòng)物PepT1有一些相似之處，但魚與哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制確實(shí)也存在著不同，哺乳動(dòng)物的最大轉(zhuǎn)運(yùn)活力與胞外pH是沒有關(guān)系的（胡夢(mèng)紅和王有基，2007）。

2 魚類PepT1基因的克隆及其分子特征

目前已有多種魚的PepT1基因被克隆，但多見于國外報(bào)道，國內(nèi)只見報(bào)道了對(duì)鯽魚基因的克隆。Verri等在2003年克隆出了斑馬魚的PepT1基因，這是第一種被克隆出的魚，通過對(duì)斑馬魚的PepTl基因進(jìn)行序列分析得到，斑馬魚PepTl cDNA全長2746 bp，其中開放閱讀框（ORF）長2157 bp，編碼一個(gè)由718個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。親水性分析預(yù)測(cè)斑馬魚PepT1至少有12個(gè)膜電位跨膜域，并且在跨膜區(qū)9和10之間有一個(gè)大的外環(huán)。有6個(gè)膜外N-糖基化位點(diǎn)，有2個(gè)膜內(nèi)含蛋白激酶C基序的相同區(qū)域以及1個(gè)已鑒定的膜內(nèi)cAMP依賴的蛋白激酶列。R?nnestad等（2007b）克隆了大西洋鱈魚的PepT1的基因，大西洋鱈魚的 PepTl cDNA全長 2838 bp，ORF長2190 bp，編碼一個(gè)由729各氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。親水性分析預(yù)測(cè)鱈魚也有12個(gè)膜電位跨膜域，在跨膜區(qū)9和10之間有一個(gè)大的外環(huán)。另外有 5個(gè)膜外N-糖基化位點(diǎn)，3個(gè)膜內(nèi) cAMP／cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，但沒有蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)。R?nnestad等（2010）又報(bào)道了大西洋鮭魚的PepT1的基因的信息。其cDNA全長2629 bp，ORF長為2205 bp，編碼蛋白由734個(gè)氨基酸殘基組成。也是12個(gè)膜電位跨膜域，跨膜區(qū)9和10之間有一個(gè)大的外環(huán)。4個(gè)膜外N-糖基化位點(diǎn)，3個(gè)膜內(nèi)cAMP／cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

國內(nèi)只見對(duì)鯽魚的PepT1基因的克隆，熊鋼（2010）的研究結(jié)果得出，PepTlDNA全長 2346 bp， 包含 149 bp 的 5’UCR，343 bp 的 3’UCR，1854 bp的開放閱讀框，編碼617個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。分子質(zhì)量為6.8974 kD，等電點(diǎn)為5.9。分析鯽魚與10個(gè)物種的基因同源性、氨基酸跨膜區(qū)同源性和預(yù)測(cè)編碼的氨基酸同源性得出：PepT1cDNA基因全長與鯉魚同源性高達(dá)99.2%，與斑馬魚、泥鰍和鰭魚的同源性分別為：76.1%、82.6%、60.6%，與哺乳動(dòng)物的同源性為54.0% ～58.4%；其基因編碼區(qū)序列和氨基酸序列相對(duì)保守，在基因編碼區(qū)鯽魚與哺乳動(dòng)物的基因同源性為61.7%～74.0%。

3 魚類PepT1基因的組織表達(dá)

魚類的消化系統(tǒng)較畜禽要簡單，大多數(shù)魚類只有一段消化道，因此，通常將魚類的消化道分為前、中、后腸。 Verri等（2003）以及 R?nnestad 等（2007a）通過設(shè)計(jì)PepT1特異性引物，利用RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)）從成年斑馬魚和鱈魚的腸道，脾和腎的總RNA中分別擴(kuò)增了長度為772 bp和681 bp的DNA產(chǎn)物，而在眼、心臟、肝臟與鰓中都未見有擴(kuò)增產(chǎn)物。R?nnestad（2010）利用qPCR（定量聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)）測(cè)得PepT1基因在腸道中表達(dá)很高，大腦中較低，而在皮膚心臟中基本沒有。熊鋼（2010）的研究認(rèn)為，PepT1在鯽魚組織表達(dá)的高低順序依次為：前腸、中腸、后腸、心臟、腎臟、肌肉、腦和肝臟。這表明魚類的PepT1基因主要分布在消化道，這可能是由于小肽的主要吸收部位是腸道所導(dǎo)致的。

PepT1基因在不同部位、不同的日糧條件或不同發(fā)育時(shí)期下表達(dá)都是不一樣的。Ostaszewska等（2010）研究了以植物性蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)日糧補(bǔ)充小肽和氨基酸對(duì)鯉魚PepT1基因表達(dá)的影響。在以小麥面筋提供蛋白的基礎(chǔ)日糧中分別添加Lys-Gly，游離 Lys、Gly，以及不添加 Lys進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，飼喂添加Lys-Gly日糧的鯉魚PepT1基因表達(dá)量最高，表達(dá)最低的為未添加Lys日糧組。這表明在日糧中添加一定量的小肽會(huì)加強(qiáng)PepT1基因的表達(dá)量，并且有利于消化道的發(fā)育與代謝。Bakke等（2010）分別以魚幽門盲囊（S1），不同腸段（分為 S2、S3、 S4 、S5）的 PepT1 基因表達(dá)量作為評(píng)估指標(biāo)研究了蛋白水解物以及游離氨基酸對(duì)PepT1基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在所有腸段中均發(fā)現(xiàn)有PepT1基因的表達(dá)，這表明所有腸段都參與了小肽吸收，但是又存在差異。飼喂魚粉的魚其S5段比S2段表達(dá)量少；而游離氨基酸組和超濾魚粉水解物組的魚其S2和S3腸段的PepT1 mRNA水平要高于其他區(qū)域段。這些數(shù)據(jù)表明，整個(gè)小腸的PepT1表達(dá)是變化的，也包括最遠(yuǎn)端部分，以應(yīng)對(duì)腸道內(nèi)蛋白內(nèi)容物的變化。這個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)可能是為了保持腸道水平的最大蛋白質(zhì)吸收效率（Terova等，2009）。

Amberg等（2008）通過原位雜交技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR來確定大西洋鱈魚幼魚攝食野生浮游動(dòng)物或輪蟲時(shí)PepT1基因的時(shí)空表達(dá)模式。試驗(yàn)結(jié)果顯示，PepT1mRNA在胚胎孵化時(shí)（先于外源性攝食）就已有表達(dá)。開始外源性攝食后，在除了食管和括約肌以及肛門區(qū)域外的消化道，均觀察到有較強(qiáng)PepT1表達(dá)。孵化后22 d，PepT1基因延續(xù)高水品的表達(dá)。

4 結(jié)語

蛋白質(zhì)在胃和小腸經(jīng)消化酶作用后的最終產(chǎn)物為游離氨基酸和小肽，分別由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體吸收轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體內(nèi)。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)動(dòng)物的營養(yǎng)有重要意義。PepT1就是其中一種很重要的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體?，F(xiàn)已有多種魚類的PepT1基因被克隆出來并測(cè)序分析，并通過各種定量PCR等方法對(duì)其組織分布與表達(dá)作了報(bào)道。但是對(duì)魚類小肽的吸收機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。這將為優(yōu)化魚類飼料配方，提高魚類養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生重要影響。

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