劉相全,包振民,方建光,王如才

(1.山東省海洋水產(chǎn)研究所,山東 煙臺 264006; 2.中國海洋大學(xué),山東 青島 266003; 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071)

線粒體DNA(mtDNA) 由于具有分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡單、表現(xiàn)為母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn),成為動物群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究中的重要對象。對于選定的基因或基因片段,可通過互補(bǔ)于高度保守區(qū)域的通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,然后進(jìn)行分子克隆測序或 PCR產(chǎn)物直接測序,對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在海洋貝類方面,根據(jù)mtDNA區(qū)段或基因的序列來構(gòu)建分子系統(tǒng)樹,并進(jìn)而進(jìn)行分類和進(jìn)化分析的研究已有許多報(bào)道。

Canapa等[1-3]根據(jù)16S rRNA基因序列分別對8種、14種簾蛤科貝類進(jìn)行聚類分析表明,綴錦蛤亞科的 6個種類盡管可以聚在一起,但在屬的水平上的分類則不能很好的對應(yīng); 對 8種扇貝科貝類的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)有兩種扇貝應(yīng)為同一種類。Barucca等[4]分析了 23種扇貝科貝類的 16S和 12S基因片段,兩個片段反應(yīng)的扇貝間的親緣關(guān)系基本一致。Matsumoto等[5-6]根據(jù) COⅠ的氨基酸序列對17種扇貝科貝類的分類進(jìn)行了研究,結(jié)果支持Waller的形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng); 對翼形亞綱的分類進(jìn)行了研究,并與18S rDNA的分類結(jié)果進(jìn)行了比較。Yu等[7]根據(jù)16S和COⅠ兩個片段的序列分析了中國沿海 4種牡蠣的分類情況。楊建敏等[8]研究了 3 種鮑的 16S rRNA 基因。Therriault等[9]根據(jù) 16S和COⅠ兩個片段的序列對黑海飾貝科的分類進(jìn)行了研究,分清了同物異名的兩個種; 16S和 COⅠ兩個片段對種內(nèi)生態(tài)型之間的差異則不能很好地區(qū)分。

蛤仔屬(Ruditapes)作為簾蛤科的一個屬,是Fischer-Piette等對綴錦蛤亞科訂正后提出的。在我國蛤仔屬只有兩個種,即菲律賓蛤仔(R.philippinarum)和雜色蛤仔(R.variegata)。為了進(jìn)一步比較這兩種在外形上酷似的簾蛤科貝類,本文通過對線粒體 DNA的16S和COⅠ兩個片段進(jìn)行擴(kuò)增、測序,分析了兩個序列的基本特征,并引用Genbank中其他2種貝類的序列,進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生的比較。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和DNA提取

菲律賓蛤仔(R.philippinarum,簡稱 RP)取自青島,雜色蛤(R.variegata,簡稱RV)取自湛江硇洲島。常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增、克隆和測序

PCR擴(kuò)增用引物：16S采用Palumbi等[10]設(shè)計(jì)的通用引物,16sar-L (5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′)和 16sbr-H (5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′); COⅠ采用 Folmer 等[11]設(shè)計(jì)的引物COIL1490/COIH2198：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG/TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。PCR擴(kuò)增采用 25μL體系,包括 30～50 ng基因組DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 μmol/L 引物,緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl,1.5 mmol/LMgCl2,50 mmol/L KCl),以及 0.025 UTaq酶/μL。94℃變性2 min,然后35個循環(huán)(94 ℃ 40 s,56℃1min,72℃1min)最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增片段在2%的瓊脂糖膠上檢測。PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T,然后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α細(xì)胞,37℃培養(yǎng),涂平板,挑克隆,載體引物檢測,雙向測序。序列提交到Genbank。

1.3 序列分析

測序結(jié)果去掉兩端引物序列后,用CLUSTALX 1軟件進(jìn)行比對,用MEGA 2軟件(Kumar等,2001)的距離法對序列進(jìn)行分析。根據(jù)Kimura(1980)雙參數(shù)法計(jì)算距離,產(chǎn)生的矩陣根據(jù) NJ法(Saitou and Nei,1987)分析系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的置信度用自展(bootstrap)重復(fù)分析驗(yàn)證(重復(fù)次數(shù) NJ為 1 000,MP為 100)。引用的序列包括硬殼蛤(Mercenaria mercenaria,簡稱 MM。16S：AJ548773,COⅠ：U47648)和白斑烏賊(Sepia latimanus,簡稱Sla。16S：AB192322,COⅠ：AB192338)以及菲律賓蛤仔16S的序列AF484296。菲律賓蛤仔COⅠ和雜色蛤仔 COⅠ、16S的序列號為 JN248565～JN248567。

2 結(jié)果

每種蛤仔用10只個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所有擴(kuò)增結(jié)果均為單一產(chǎn)物。兩種蛤仔的序列長度和 4種堿基的含量見表1、表2。菲律賓蛤仔和雜色蛤仔16S序列長度分別為511 bp和476 bp,COⅠ序列的長度都是 658 bp,結(jié)合對軟體動物相關(guān)片段的分析,這兩個片段具有明顯的長度保守性。兩個片段的GC含量菲律賓蛤仔都低于雜色蛤仔,而 GC含量都低于AT含量,符合線粒體DNA的堿基組成特點(diǎn)。兩個片段的GC含量比較接近,但COⅠ基因片段堿基T的含量要明顯高于16S rRNA基因片段核苷酸中T堿基的含量。

表1 兩種蛤仔16S序列的長度以及堿基組成Tab.1 Size and GC content of the 16S rRNA gene

表2 兩種蛤仔COⅠ序列的長度以及堿基組成Tab.2 Size and GC content of the COⅠgene

兩種蛤仔 COⅠ基因片段 658個核苷酸編碼的20種氨基酸組成的219個氨基酸序列中,都是亮氨酸(Leu)含量最高,分別為 16.44%(RP)和14.16%(RV)。排在其后的氨基酸含量兩種蛤仔略有不同,菲律賓蛤仔依次是甘氨酸(Gly),甲硫氨酸(Met),而雜色蛤仔為甲硫氨酸(Met),甘氨酸(Gly)。從總體看,兩種蛤仔的氨基酸組成還是具有較高的相似性(表 3)。

表3 兩種蛤仔COⅠ基因的氨基酸組成Tab.3 The amino acid composition(%) of the COⅠgene

兩種蛤仔16S序列比對結(jié)果見圖1。516個位點(diǎn)中共有 117個變異位點(diǎn)(其中,插入缺失 44,多態(tài)位點(diǎn)73個),COⅠ序列658個位點(diǎn)中共有160個變異位點(diǎn),全是多態(tài)位點(diǎn),沒有插入缺失(圖2)。COⅠ基因編碼的219個氨基酸序列,兩種蛤仔有29個氨基酸不同(圖 3)。

圖1 兩種蛤仔16S序列的比對圖Fig.1 Alignment of 16S rDNA sequences of two clams

以 16S序列計(jì)算兩種蛤仔與其他幾種貝類的堿基替換/顛換率以及距離,以 COⅠ基因編碼的氨基酸序列計(jì)算兩兩之間的遺傳距離,結(jié)果見表4。兩兩之間的遺傳距離最小值 16S的結(jié)果在菲律賓蛤仔與雜色蛤仔之間為0.17,而COⅠ氨基酸序列的結(jié)果在雜色蛤仔與硬殼蛤之間為 0.14,不過與兩種蛤仔之間的遺傳距離0.15非常接近。

系統(tǒng)關(guān)系分析分別用16S序列和COⅠ編碼的蛋白序列進(jìn)行。根據(jù)16S序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹見圖4,NJ樹和MP樹完全一致,兩種蛤仔都聚為一支,硬殼蛤與白斑烏賊單獨(dú)聚為一支,這與傳統(tǒng)的分類是一致的。而根據(jù)COⅠ基因編碼的蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(圖5),與16S序列的結(jié)果不太一致,NJ樹雖將兩種蛤仔聚在一起,但這一支的置信度比較低,也就是說,兩種蛤仔與硬殼蛤的差異不是很大; 而MP樹則將兩種蛤仔與硬殼蛤聚為一支,說明這三種蛤之間的差異非常小。

圖2 兩種蛤仔COⅠ序列的比對圖Fig.2 Alignment of COⅠgene sequences of two clams

圖3 兩種蛤仔COⅠ蛋白序列的比對圖Fig.3 Alignment of the amino acid sequences of COⅠgene of two clams

表4 4種貝類兩兩之間的遺傳距離(分別對16S和COⅠ編碼的氨基酸序列)Tab.4 The pair-wise genetic distance matrix of COⅠand 16S rRNA gene

圖4 根據(jù)16S序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic relationships based on 16S rRNA sequences

圖5 根據(jù)COⅠ基因編碼的蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.5 Phylogenetic relationships based on the amino acid sequences of COⅠgenes

3 討論

簾蛤科貝類在全世界廣為分布,包括 500多個種類,許多種類都具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。簾蛤科貝類生活習(xí)性比較一致,形態(tài)也比較相似,這使得根據(jù)形態(tài)對系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析非常困難。因此,許多的生化手段被用來研究簾蛤科的分類問題,而分子生物學(xué)的研究還剛剛開始。本文得到了兩種蛤仔線粒體DNA 16S rRNA和COⅠ兩個片段的序列,分析了兩種蛤仔這兩個片段的序列特征,并從進(jìn)化的角度分析了它們的變異,為利用分子生物學(xué)的方法研究簾蛤科的分類提供了一定的依據(jù)。

蛤仔屬在簾蛤科中的分類地位一直存在著爭議,其屬下種的歸屬問題也曾經(jīng)比較混亂。因?yàn)楦蜃袑賀uditapes和綴錦蛤?qū)賂apes、石蛤?qū)賄enerupis的親緣關(guān)系很近,形態(tài)結(jié)構(gòu)非常相似。1951年,Keen把Ruditapes作為Tapes的亞屬。1971年,法國自然史博物館Fischer-Piette和Metivier對綴錦蛤亞科各個屬鉸合部主齒板的形態(tài)進(jìn)行了仔細(xì)比較研究后,把Ruditapes提升為屬,根據(jù)他們的分類系統(tǒng),菲律賓蛤仔與雜色蛤仔都應(yīng)當(dāng)是在Ruditapes的屬下[12]。

本文對 16S序列的分析結(jié)果表明,兩種蛤仔的親緣關(guān)系比較接近,而與同為簾蛤科的硬殼蛤有明顯的差異。但對COⅠ序列的分析結(jié)果則表明,兩種蛤仔之間的關(guān)系以及它們與硬殼蛤之間的關(guān)系差異不明顯。不同的DNA片段進(jìn)行聚類分析會產(chǎn)生不同的結(jié)果[13],這說明蛤仔屬與其他相近屬種的親緣關(guān)系非常接近。潘鶴婷等[14]的聚類結(jié)果也表明兩種蛤仔不能聚為一支。Canapa等[3]對簾蛤科貝類根據(jù) 16S rRNA 基因序列的研究表明,綴錦蛤亞科的6個種類盡管可以聚在一起,但在屬的水平上的分類則不能很好的對應(yīng),其中的菲律賓蛤仔與錯紋蛤仔(Ruditapes decussatus)就不能在屬的水平上聚類。一般認(rèn)為,COⅠ序列比 16S序列具有更大的變異性,因此,在區(qū)分近緣種的分類關(guān)系上,COⅠ序列比16S序列更靈敏。Boudry等[15]用9種內(nèi)切酶對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)和葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)的253個個體的16S序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,未發(fā)現(xiàn)有任何酶切位點(diǎn)變異; 但用4種內(nèi)切酶對同樣個體的COⅠ序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,卻檢測到了明顯的多態(tài)性。

對簾蛤科綴錦蛤亞科各個屬及屬內(nèi)包含的種進(jìn)行細(xì)致明確的分類,需要對更多相近種分析更多的DNA序列,包括核DNA和線粒體DNA的序列。在系統(tǒng)演化研究中,采用多組分子生物學(xué)數(shù)據(jù)并結(jié)合形態(tài)特征、解剖結(jié)構(gòu)等分析,將有助于正確闡述物種間真實(shí)的進(jìn)化關(guān)系以及某個物種在系統(tǒng)演化中的確切地位。

[1]Canapa A,Barucca M,Marinelli A,et al.Molecular data from the 16S rRNA gene for the phylogeny of Pectinidae (Mollusca：Bivalvia) [J].J Mol Evol,2000,50：93-97.

[2]Canapa A,Marota I,Rollo F,et al.Phylogenetic analysis of Veneridae (Bivalvia)：Comparison of molecular and palaeontological data[J].J Mol Evol,1996,43：517-522.

[3]Canapa A,Schiaparelli S,Marota,et al.Molecular data from the 16S rRNA gene for the phylogeny of Veneridae (Mollusca：Bivalvia) [J].Marine Biology,2003,142：1125-1130.

[4]Barucca M,Olmo E,Schiaparelli S,et al.Molecular phylogeny of the family Pectinidae (Mollusca：Bivalvia)based on mitochondrial 16S and 12S rRNA genes[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2004,31：89-95.

[5]Matsumoto M.Phylogenetic analysis of the subclass Pteriomorphia (Bivalvia) from mtDNA COI sequences[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2003,27：429-440.

[6]Matsumoto M,Hayami I.Phylogenetic analysis of the family Pectinidae (Bivalvia) based on mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I[J].J Moll Stud,2000,66：477-488.

[7]Yu Z N,Kong X Y,Zhang L S,et al.Taxonomic status of four Crassostrea oysters from China as inferred from mitochondrial DNA sequences[J].Journal of Shellfish Research,2003,22(1)：31-38.

[8]楊建敏,鄭小東,王如才,等.3種鮑16S rRNA 基因片段序列的初步研究[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2003,33(1)：36-40.

[9]Therriault T W,Docker M F,Orlova M I,et al.Molecular resolution of the family Dreissenidae (Mollusca：Bivalvia) with emphasis on Ponto-Caspian species,including first report ofMytilopsis leucophaeatain the Black Sea basin[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2004,30(3)：479-489.

[10]Palumbi S R,Martin A,Romano S,et al.The simple fool’s guide to PCR[J].Honolulu：University of Hawaii Press,1991.

[11]Folmer O,Black M,Hoeh W,et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Mol Mar Biol Biotechnol,1994,3：294-299.

[12]莊啟謙.中國動物志：軟體動物門 雙殼綱 簾蛤科[M].北京：科學(xué)出版社,2001：41-52.

[13]劉相全,包振民,胡景杰,等.幾種簾形目貝類 rDNA ITS序列的比較[J].高技術(shù)通訊,2007,17(4)：435-440.

[14]潘鶴婷,袁媛,吳琪,等.綴錦蛤亞科(Tapetinae)貝類線粒體 DNA序列的系統(tǒng)學(xué)分析[J].海洋與湖沼,2008,39(3)：284-290.

[15]Boudry P S,Heurtebise S,Collet B,et al.Differentiation between population of the Portuguese oyster,Crassostrea angulata(Lamark)and the Pacific oyster,Crassostrea gigas(Thunberg),revealed by mtDNA RFLP analysis[J].J Exp Mar Biol Eco,1998,226：279-291.